[发明专利]含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺以及纯化Kringle 5蛋白的工艺

权利要求书

1、含Kringle 5基因的工程菌的发酵工艺是，其特征在于：

设计了15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基；采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺；按照摇瓶培养优化后的条件，在micro DCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40％。

2、纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于：

(1)根据Kringle5DNA序列，设计了从重组质粒pThioA/K5中钓Kringle5的上下游引物，并在其中分别加入了Nco I和EcoR I酶切位点，在一定条件下，通过PCR反应进行Kringle5片段的扩增，扩增产物用1％-2％的琼脂糖电泳检测后，在一定条件下酶切，再将酶切产物全部进行1％-2％的琼脂糖凝胶电泳，将载体双酶切片段和Kringle5双酶切片段酶连，所获得的重组质粒pET32a/K5按常规方法转入BL21(DE3)后进行培养，重组质粒和重组菌提质粒后均用Nco I和EcoR I双酶切鉴定后进行序列分析；

(2)设计了15种不同的发酵培养基，在摇瓶培养方式下，通过测定工程菌在15种培养基中的比生长速率和目的蛋白kringle5的表达量，确定了适宜于工程菌生长和目的蛋白表达的培养基，采用优化后的培养基，通过正交试验，确定了最佳的发酵工艺，温度大约35℃，pH值6.5-7.0，摇床转速200r/min-260r/min，接种量8％-10％，诱导剂量0.6mmol/L-1.0mmol/L，诱导时机为工程菌生长的中后期，诱导时间6h-8h。按照摇瓶培养优化后的条件，在microDCU-400型20L自控罐中进行分批培养，确定了最佳的溶氧范围大约为40％，菌体浓度通过分光光度计测定OD600而获得，Kringle 5蛋白表达水平的测定用SDS-PAGE电泳法，总蛋白的测定用Bradford方法，葡萄糖浓度的测定用3，5-二硝基水杨酸法；

(3)发酵后离心收集的菌体重悬于A液，A液为加入一定量NaCl的PBS缓冲液，pH在7.0左右，冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀，沉淀用3-5M左右的尿素、0.5％-1.0％左右的Triton X-100和0.5-1.0M的NaCl分别洗涤一次后，溶于含20-30M PBS的盐酸胍溶液，离心后取澄清液与上清液合并直接上亲和层析柱，用B液洗脱，等度洗脱，介质选用商品化的亲合层析介质，B液为在A液中加入一定量的咪唑，收集洗脱峰；

(4)将收集的洗脱峰直接上阳离子交换层析柱，阳离子交换层析的A液可选用pH在5.0左右的HAc-NaAc溶液，B液为在A液中加入0.3-0.5M左右的NaCl，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阳离子交换介质，收集阳离子层析后含肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5峰；

(5)上一步的含有kringle5峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5。

3、根据权利要求2所述的纯化Kringle 5蛋白的两步工艺，其特征在于：

采用阳离子交换层析柱纯化时，A液用HAc-NaAc组成的pH在5.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入0.3-0.5M左右的NaCl，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阳离子交换介质。