[发明专利]具有生物活性的组织修补材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的组织修补材料及其制备方法。 

背景技术

器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内在的基因序列，在很大程度上还受到外界环境因素的影响，包括细胞与细胞外基质的相互作用。细胞外基质不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是细胞与细胞外基质的相互作用能调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和功能代谢。因此，在组织工程研究中制备利于种子细胞粘附、增殖和分化的细胞外基质材料是十分重要和迫切的。 

小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa，SIS)来源于小肠，是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的IV、V型胶原，还包含氨基葡聚糖和糖蛋白等，近年来被较多应用于血管、腹壁等多种组织缺损的修补，是理想的生物支架材料。 

SIS在体内能引导、支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适用于组织工程的支架材料。SIS中含有多种生长因子，即使经过脱细胞处理后仍然含有这些生长因子，在创伤愈合的早期阶段可以为组织再生创造合适的微环境。这是其它天然材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖和聚乳酸、聚羟基乙酸)所不能比拟的。

然而，SIS的成分主要是由动物细胞分泌合成，包括有胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质成分，与人体的成分存在有差异，因此植入体内后难以与人体相融合，可能激发机体的异物反应或免疫排斥反应，使其在使用中受到限制。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有生物活性的组织修补材料及其制备方法，使所制备的修补材料含有来自人体的活细胞及其分泌合成的细胞外基质和多种生长因子，能用于修复软组织器官缺损并促进损伤愈合，具有生物相容性高、无毒害、显著降低免疫排斥反应的优点。 

本发明所提出的具有生物活性的组织修补材料，是在脱细胞小肠粘膜下层上复合有人体活细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成；所述的脱细胞小肠粘膜下层是将哺乳动物空肠经脱细胞处理后获得；所述的人体活细胞为成体细胞、或是成体干细胞，包括成纤维细胞、表皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞的任一种或是几种，其选择是根据所修复组织受区的需求来确定。 

本发明具有生物活性的组织修补材料的制备方法，包括细胞获取、脱细胞SIS制备以及具有生物活性的组织修补材料的制备，具体步骤如下： 

1)、细胞获取：细胞来自人体组织，根据所修复组织受区的需求选择细胞的类型，按常规的细胞培养方法进行体外培养，细胞的大规模扩增可采用细胞工厂、生物反应器的方法进行； 

2)、脱细胞小肠粘膜下层的制备：取哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成所需长度，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时；用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗，获得粘膜下层；将其置入0.1～1M的NaOH溶液中浸泡8分钟以上，以达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用PBS漂洗至pH中性；再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS漂洗；为使种植细胞更容易贴附，经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)的任一种溶液浸泡20分钟以上，再经干燥后形成脱细胞小肠粘膜下层，灭菌消毒；其中，所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml；

3)、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM67.5％、商用培养液F1222.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～50μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml，维生素C10～50μg/ml。