[发明专利]一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境水体的检测方法，特别涉及一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法，该方法用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，QPCR)方法检测水体中的肠道病原细菌，适合于水体中大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、伤寒杆菌(Salmonella typhrmurium)的定量检测。

背景技术

城市污染的加重，使更多未经处理的污水直接排放到地表环境，从而引发人类多种疾病甚至死亡，这在发展中国家尤为严重。尤其是通过水域传播的疾病，如痢疾、伤寒、霍乱，以及旅行中常见的腹泻等，都是由致病细菌引起的。由此，水域性病原菌的常规监测，对于公共健康来说是非常重要的。但由于缺乏精确和费用低廉的检测方法，使得预防和控制水域传染病暴发受到阻碍。

对于水体中病原菌的检测主要基于选择性培养和标准的生物化学方法。但这些方法存在一系列的缺陷。首先，水体中的病原细菌通常含量很少，取样和计数过程可能导致较大误差。其次，细菌培养方法通常费时、费力，检测单一。第三，环境中的病原微生物，有些很难培养甚至不能培养，却仍然能致病。很明显，发展新的病原细菌检测方法势在必行。近年来发展起来一系列免疫学方法，用于检测沙门氏菌、霍乱弧菌等病原菌。遗憾的是这些方法的灵敏度不稳定，并且影响因素很多。越来越多的人开始研究分子生物学方法的可行性，以求缩短检测和报告时间。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应(QPCR)体系，定量测定环境水体中包括大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌在内的细菌细胞密度，该方法能够同时检测多种肠道病原细菌，测试时间短，测定结果准确、稳定、重现性好。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，其特征在于，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：

步骤一，设计并合成肠道病原细菌PCR通用引物：

该肠道病原细菌的PCR通用引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’，

下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’；

步骤二，制作定量PCR标准曲线：

标准曲线的纵坐标是已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值，横坐标是相应的埃希氏大肠杆菌细胞密度；

步骤三，细菌浓缩回收及细菌DNA提取：

地表水水样通过离心收集细菌细胞，细菌DNA的提取采用细菌裂解缓冲液及苯酚-氯仿法提取；

步骤四，定量PCR反应体系及相关参数的确定：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上、下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min。阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍；

步骤五，结果计算：

通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。

本发明与现有检测方法的比较，具有下列特点：

(1)能够同时检测水体中常见的4种病原细菌(大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌)，检测结果更能反映水体的真实污染情况。

(2)检测迅速，耗时短。本发明方法从取样到出结果可以在5个小时内完成，而常规MF方法需要1-3天才能出结果。