[发明专利]人与模式生物功能基因电子克隆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及遗传工程技术，具体涉及一种利用EST与人及模式生物基因组草图序列信息进行人与模式生物功能基因电子克隆的方法。

背景技术

电子克隆是近年来伴随着人类基因组计划和EST(表达序列标签)计划发展起来的基因克隆新方法，主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)的方法快速获得功能基因，具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。随着人类基因组计划的实施，已有研究人员利用电子克隆的方法克隆了很多人与模式生物的功能基因。目前利用电子克隆进行生物体功能基因发掘的方法有两种：

1利用EST数据库信息

利用EST数据库信息进行功能基因的电子克隆是目前最常用的手段。首先选择感兴趣的目标EST作为查询探针，搜索dbEST(非冗余EST)数据库，找到部分重叠的EST进行拼接，然后再以拼接好的EST重叠群((EST contig)为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA(互补脱氧核糖核酸)克隆并进行序列测定验证，(参见图1)。

2利用基因组信息

随着人类基因组以及一大批模式基因组序列测序的完成，并供全世界免费使用，促进了生物功能基因的电子克隆。它以EST或全长cDNA序列作为信息探针，搜索GenBank(核苷酸数据库)，随后根据内含子“GU...AG”的规则通过人工拼接或相应的计算机软件处理，可以得到该基因完整的开放读码框(ORF)，根据拼接的序列结果设计PCR引物，进一步采取RT-PCR的方法获得目的基因的cDNA克隆并进行序列测定，(参见图2)。

发明内容

本发明的目的在于利用EST与人及模式生物基因组草图序列信息进行功能基因的电子克隆，提出一种具有广泛适用性的人及模式生物功能基因电子克隆的方法。

本发明是按以下步骤实现的。

一种人与模式生物功能基因电子克隆的方法，具体步骤如下：

(1)利用感兴趣的EST片段作为查询探针搜索dbEST库，找到与该序列同源的所有EST序列；

(2)分别将EST序列同源的所有EST片段，通过DNAstar软件进行EST拼接、延伸获得大片段或全长cDNA，获得一致序列其中包括潜在的核苷酸多态性信息；

(3)以获得的一致序列作为查询序列在UCSC服务器上执行BLAT比对分析，获得包括一个新基因所对应的完整EST序列、mRNA序列和相应基因组图谱序列，以及可能的可变剪切体以及EST表达谱的详细信息；

(4)综合上述三个步骤的结果，拼接外显子，最终获得得到GenBankEST数据库和基因组图谱双重支持，同时包含基因可变剪切体、核苷酸多态性以及组织表达等完整信息的cDNA序列；

(5)确定新基因编码区序列：生物信息学分析包含候选开放读码框架的cDNA典型基因特征，如开放读码框架(ORF)前有无终止码和启动子，Kozak规则，加尾信号，polyA等，进行种属基因的比较基因组分析，通过种属内同源蛋白的氨基酸序列确定该新基因的翻译起始点。

(6)根据预测的功能基因设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。

所述人与模式生物功能基因电子克隆的方法，其基因组序列与EST序列一致，直接拼接外显子。

所述人与模式生物功能基因电子克隆的方法，其基因组序列与EST序列不一致，则根据有两个以上EST序列支持的核苷酸进行拼接外显子。

所述人与模式生物功能基因电子克隆的方法，对同时存在有两个以上EST序列(包括一个EST序列支持基因组序列的情况)支持的核苷酸位点确定为单核苷酸多态性；

所述人与模式生物功能基因电子克隆的方法，其外显子拼接过程中，EST数据库中缺少对应的核苷酸序列且已知存在种属同源基因的氨基酸，则以该氨基酸序列为查询序列用TBLASTN程序比对以获得预测的编码序列。

所述人与模式生物功能基因电子克隆的方法，其生物信息学分析不符合上述典型基因特征，则通过种属同源蛋白的氨基酸序列的比对确定新基因真实翻译起始和终止点。