[发明专利]HPLC法同时测定蒲公英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及中药质量检测领域，特别是一种HPLC法同时测定蒲公英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法。

二、背景技术

蒲公英为常用中药，但其药材品种比较混乱，质量不易控制，对其质量控制还没有统一的标准。中国药典对蒲公英的质量控制仅局限于咖啡酸单种成分的薄层鉴别及含量测定，仍采用了对西药质量控制的模式，不能全面地反映蒲公英的内在质量。咖啡酸、绿原酸为蒲公英中清热解毒成分，因蒲公英所含成分比较复杂，难以把咖啡酸、绿原酸与其它成分很好的分离，达到液相定量测定的要求，中国药典(2005年版)中蒲公英的含量测定项下，仅用HPLC法测定其中一个咖啡酸的含量，而绿原酸也为蒲公英中主要的抗菌成分，仅测出咖啡酸含量，并不能全面反映出蒲公英制剂的质量情况，故建立一种能同时测定蒲公英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法具有重要的意义。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有蒲公英药材的质量控制缺陷，本发明的目的在于提供一种HPLC法同时测定蒲公英药材中绿原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解决以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，同时进行含量测定，对蒲公英药材的质量标准奠定基础的问题，实现本发明的具体技术方案是：分别制备供试品溶液和对照品溶液，用RP-HPLC法(反相高效液相色谱法)测定绿原酸、咖啡酸含量，其特征是：

色谱条件为：色谱柱为AichromBond-AQ柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.015％磷酸水，其中流动相A为甲醇，流动相B为体积浓度0.015％的磷酸水，采用梯度洗脱，0.01-20min时，流动相A∶流动相B的体积比为20％∶80％(即0.01min时，流动相A与流动相B的体积比为20％∶80％，保持到20min)，在20-40min，流动相A∶流动相B的体积比为30％∶70％(即在20-40min时，流动相A与流动相B的体积比由初始时的20％∶80％逐渐改变到30％∶70％)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0ml/min，检测波长为323nm，柱温30℃～40℃。

柱温最优为35℃。

表1梯度洗脱程序

在测定绿原酸、咖啡酸含量前，利用流动相先对色谱柱进行平衡，流动相A与流动相B初始体积比为30％∶70％，在0-2min，流动相A与流动相B的体积比改变为20％∶80％，保持到22min，流速为1.0ml/min，平衡色谱柱程序见表2。

表2平衡色谱柱程序

本发明测定方法中，供试品溶液和对照品溶液的制备方法为：

取蒲公英药材粉末0.5g左右，加入体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液(5％甲酸的甲酸甲醇溶液或称为5％甲酸的甲醇溶液，是指以体积计：甲酸5％、甲醇95％构成的溶液，以下同)10ml，称定重量，超声提取30min，取出，放至18-25℃，加体积浓度为5％甲酸的甲酸甲醇溶液补足减失重量，过滤，取续滤液，再过滤，得蒲公英药材供试品溶液；

取咖啡酸对照品，加甲醇配成咖啡酸质量浓度为0.066mg/ml的咖啡酸溶液，过滤，即得咖啡酸对照品溶液。

取绿原酸对照品，加甲醇配成绿原酸质量浓度为0.0784mg/ml的绿原酸溶液，过滤，即得绿原酸对照品溶液。

称取蒲公英药材，分别加入0.0784mg/ml绿原酸对照品溶液1ml，0.066mg/ml咖啡酸对照品溶液2.5ml，即加入绿原酸对照品0.0784mg，咖啡酸对照品0.165mg，得混合对照品溶液。

上述制备的供试品溶液和对照品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，进样量为5μl，记录时间40min。

本发明采用RP-HPLC法(反相高效液相色谱法)，梯度洗脱，测得蒲公英制剂中绿原酸、咖啡酸含量。结果：咖啡酸在0.0264μg～0.528μg范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.09％，RSD为1.52％；绿原酸在0.03136μg～0.6272μg范围内有良好的线性关系，平均回收率为98.52％，RSD为1.64％。本发明方法简便、可靠、迅速，灵敏度高，重现性好，回收率高，以绿原酸和咖啡酸作为指标性成分，为蒲公英药材质量标准的制定奠定了基础，提供了更科学的依据。

四、附图说明

图1为咖啡酸对照品色谱图。

图2为绿原酸对照品色谱图。

图3为蒲公英药材供试品色谱图。

五、具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

1.仪器与试药