[发明专利]侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体是一种侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法。 

背景技术

因具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子(p^plb)驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能力大(30-50kb)、表达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES，Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。目前主要使用两种杆状病毒表达系统，一种为商业化的AcNPV-sf9或者AcNPV-High5系统，该系统利用重组AcNPV在离体培养细胞sf9或者High5中进行外源基因表达。另外一种就是BmNPV-家蚕幼虫表达系统，该系统利用重组BmNPV在家蚕活体内进行蛋白表达。家蚕饲养在我国具悠久的历史，其培养方式简单，成本较低，其成本为细胞培养的1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的10倍左右，因此杆状病毒-家蚕表达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优势。 

无论何种重组杆状病毒，最后都必须通过将提取的重组病毒DNA转染昆虫细胞产生杆状病毒粒子，以达到蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互 作用研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等应用。目前将DNA载体(包括Bacmid DNA)转染进昆虫宿主细胞的方法有脂质体(lipofectin)介导的转染法，磷酸钙-DNA共沉淀法和显微注射法。其中磷酸钙-DNA共沉淀法成本最低，对DNA质量要求非常高，而且对操作以及PH值要求严格，PH值微小的改变就可导致转染效率急剧下降，因此总体转染效率不高，重复性较差，转染效果不稳定。脂质体(lipfectin)介导的转染方法简单，且转化常规小质粒效率较高(40-80％)，而转染100kb以上的大质粒的效率相对较低(5-10％)。但是脂质体价格极其昂贵，实验成本太高，和磷酸钙转染一样，依然需要提取和精制高质量DNA，再与脂质体进行混合，转染过程比较复杂耗时。显微注射法操作过程烦琐，需要价值上百万的显微操作系统支持，成本极高，和操作者的经验密切相关，主要用于单细胞注射试验，普通实验室根本不可能使用。无论是磷酸钙还是脂质体转染法，都需要制备高纯度的DNA和试剂按一定的比例进行混合，让DNA与脂质体或者磷酸钙形成复合体，再经过复杂的转染操作过程才能转染进细胞。因此现有的这几种DNA进入昆虫宿主细胞的转染方法都有其局限性，限制了杆状病毒表达系统的广泛利用。 

发明内容：

为解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种避免复杂昂贵的昆虫细胞转染过程，从而经济、快速、高效侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法。 

为实现上述发明目的，本发明所述的侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子的方法按下述步骤实现：(1)构建DAP营养缺陷型菌株E.coli ΔASD DH10B； 

(2)将ACBacmid和转座辅助质粒以及表达侵染蛋白助手质粒PGB2Ωinv 电转化进E.coli ΔASD DH10B，构建新的感染性受体菌ΔASD DH10Bac/PGB2Ωinv；(3)用pFastBacI载体将外源基因同源重组入上述ACBacmid中，获得重组ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv；(4)重组ΔASDDH10Bac/PGB2Ωinv直接感染昆虫细胞sf21从而获得重组杆状病毒粒子。 

本发明的理论依据：asd是编码二氨基庚二酸的基因，是细胞壁合成的重要成分，在确实asd基因的情况下，细菌必须补加DAP(二氨基庚二酸)以维持细菌的生存和繁殖。Inv基因来自Yersinia pesudotuberculosis的基因组，编码103kDa的细菌外膜侵染蛋白Invasin，Yersinia pesudotuberculosis可以感染人和动物，其感染主要方式是通过侵染蛋白Invasin与β1受体家族的结合，帮助细菌进入人或哺乳动物细胞。采用缺失大肠杆菌DH10B基因组中的asd基因，使大肠杆菌细胞壁合成受阻，大肠杆菌菌液和昆虫细胞混合后，通过PGB2Ωinv质粒表达的Invasin蛋白，与昆虫细胞上的受体结合，通过受体介导的内吞作用，大肠杆菌进入昆虫细胞，然后不再对其补加DAP，大肠杆菌在细胞内裂解，释放出DNA感染昆虫细胞。