[发明专利]BmNPV－家蚕幼虫多基因表达系统构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统的构建方法。

背景技术

因为具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子(polh)驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能力大(30-50kb)、表达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES，Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。目前主要使用两种杆状病毒表达系统，一种为商业化的AcNPV-sf9或者AcNPV-High5系统，该系统利用重组AcNPV在离体培养细胞sf9或者High5中进行外源基因表达。另外一种就是BmNPV(家蚕核型多角体病毒)-家蚕幼虫表达系统，该系统利用重组BmNPV在家蚕活体内进行蛋白表达。家蚕饲养在我国具有悠久的历史，其培养方式简单，成本较低，其成本为细胞培养的1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的10倍左右，因此BmNPV-家蚕幼虫表达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优势。

但是BmNPV-家蚕幼虫表达系统也有其缺点：由于转移载体大小局限性，一个供体质粒最多只能携带4个外源基因表达盒，对于使用BmNPV-家蚕幼虫表达系统同时表达多个外源基因有很大的局限性。以生产病毒样颗粒(VLPs)为例，在昆虫细胞中通过表达2个以上的病毒结构蛋白获得VLPs一般有两种策略：其一是构建数个不同的重组杆状病毒，每个杆状病毒表达一个结构基因，再使用几种重组杆状病毒同时感染细胞，让同一细胞内同时表达几个结构蛋白，再自我组装成VLPs。另外一种方法就是通过携带多个启动子的供体质粒，同时将多个目的基因克隆到NPV基因组中，只需要一种重组杆状病毒感染昆虫细胞即可表达几个目的蛋白，然后再组装成VLPs.早期多以前一种方式为主，该方法操作比较繁琐，需要构建几个重组杆状病毒，在感染过程中因难以保证多个杆状病毒同时进入每一个细胞，可能会造成VLPs组装量较少。随着构建重组杆状病毒技术的发展，尤其同时克隆多个(2～4)表达盒技术的出现，目前多使用后一种技术获得VLPs，其操作相对简单，VLPs产出量较高，但由于BmNPV-家蚕幼虫表达系统在多基因表达方面的局限性，限制了使用其生产VLPs的广泛利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统的构建方法，可引入多个基因到BmBacmid中，在家蚕细胞或幼虫中实现高效经济表达多个基因或者蛋白复合物，特别是为BmNPV-家蚕幼虫生产病毒样颗粒(VLPs)提供基础。

本发明BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统构建方法按下述步骤实现：(1)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I-SceI表达盒重组到E.coli DH10B的基因组中获得新的受体菌I-SceI DH10B；(2)结合转移用供体质粒的构建；(3)Cre/loxp重组位点取代BmBacmid基因组中的v-cath和chitin基因，2个I-SceI位点取代BmBacmid中的p10基因获得受体I-sceI BmMultibac；(4)利用cre-loxp重组、Tn7重组和结合转移三种方法引入外源基因；(5)常规方法制备重组Bacmid DNA并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。

本发明的理论依据：细菌间结合转移能够方便地实现DNA在细菌间的传递，转移载体进入受体细菌后可以通过诱导受体细菌表达归位酶将载体线性化，同时表达重组酶将目的片段重组到合适的受体中，从而获得重组杆状病毒。Cre/loxp和Tn7特异性重组作为两种不同的重组方式，在各自辅助酶的帮助下实现同源重组，获得重组杆状病毒。这三种获得重组杆状病毒的方式不同，三者之间没有相互影响，结合使用可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。

有益效果：

本发明同时利用cre-loxp重组位点、Tn7重组位点和结合转移三种方法引入外源基因可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。本发明获得BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统，不但可以实现单个基因多拷贝数的表达，还可以同时表达多达12个外源基因，为研究多亚基蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用以及制备病毒样颗粒奠定基础。

附图说明