[发明专利]扩张青霉转糖基β－半乳糖苷酶基因及其应用

说明书

发明领域

本发明涉及一种转糖基β-半乳糖苷酶基因，尤其涉及一种来源于扩张青霉的转糖基 β-半乳糖苷酶基因及其应用。

技术背景

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC.3.2.1.23)，又称乳糖酶，广泛存在于动物、 植物和微生物中，能水解多糖或寡糖中的β-半乳糖苷键，也能催化转糖基反应。其水解活 性可用于水解牛乳、乳清粉和其他乳制品中的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，解决乳糖不耐症 患者的乳品消费问题等；还可用于水解硝基苯-β-D-半乳糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷，生成显色物质，作为分子生物学筛选重组克隆的一种工具。近年来，随着糖生物 学的发展，β-半乳糖苷酶逐渐成为糖类合成的重要工具之一，其转糖基活性被应用于合成 功能性低聚半乳糖和具有生物活性的半乳糖苷化合物，如合成烷基糖苷类表面活性剂和糖基 化的抗生素等。

β-半乳糖苷酶所催化的转糖基反应处于水解与合成的动态平衡状态，转糖基新生成的 低聚糖及糖苷产物也可以作为底物被酶重新水解，导致转糖基产物的产量不高。为从根本上 解决这一问题，研究人员对β-半乳糖苷酶进行分子改造，在酶催化中心用非亲核体氨基酸 残基取代亲核体催化氨基酸残基，产生了一种命名为糖苷合成酶(Glycosynthases)的新型活 性酶，只催化合成反应，彻底解决了产物被水解的问题，从根本上提高了糖苷酶的转糖基效 率，产物产量可高达100％。目前，国际上β-半乳糖苷合成酶的来源还只局限于大肠杆菌， 该酶特异合成β-1，6键，而真菌来源的β-半乳糖苷合成酶未见报道。因此，寻找并获得 不同来源尤其是真菌来源的转糖基β-半乳糖苷酶基因，对于今后在此基础上进行分子改造 获得新的半乳糖苷合成酶具有非常重要的理论意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种来源于扩张青霉的转糖基β-半乳糖苷酶基因及 其应用。

一种转糖基β-半乳糖苷酶基因，它来源于扩张青霉(Penicillium expansum)F3CGMCC No.2352，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，全长3036碱基。

一种由上述转糖基β-半乳糖苷酶基因编码的转糖基β-半乳糖苷酶，它具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列，全长1011个氨基酸。

一种插入了包含上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

所述核苷酸序列插入pPIC9K表达载体。

一种插入了包含上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No.1序列载体的重组 细胞。

所述的重组细胞为毕氏酵母。

所述转糖基β-半乳糖苷酶在制药、食品领域方面的应用。

上述转糖基β-半乳糖苷酶基因在基因表达方面的应用，通过将转糖基β-半乳糖苷酶 基因克隆到pPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS115(Pichia pastoris GS115)，甲醇诱导 高效表达重组β-半乳糖苷酶。

上述转糖基β-半乳糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶为二亚基蛋白，聚合体分子 量为240±10kDa，单亚基分子量为120±5kDa；酶对邻硝基苯-β-D-半乳糖苷 (o-hitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)的适宜反应的温度为50℃～55℃，适 宜反应的pH为3.0～8.0；以pH7.0的磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液配制的酶溶液在温度 50℃条件下，能稳定保存至少55个小时，在25℃能稳定保存至少3个月；于4℃保存时， 在pH2.4～9.0范围内至少稳定保存24小时；Hg²⁺、Ag⁺强烈抑制酶的活性，K⁺、Na⁺、NH₄⁺、 Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺激活酶的活性；酶对乳糖的Km值为1.18mmol/L，酶对邻硝基苯-β-D- 半乳糖苷的k_m值为4.25mmol/L，酶对对硝基苯-β-D-半乳糖苷 (p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG)的K_m值为0.38mmol/L。