[发明专利]海洋高等真菌的大批量长期保存方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物学领域，海洋高等真菌的大批量长期保存方法。

背景技术

分离获得的真菌要有适当的方法予以保存，以保持它的生活力和原有的性状，并同时避免杂菌的污染。海洋高等真菌是一类重要的海洋微生物资源，由于针对该类微生物的研究起步较晚，迄今已报道的海洋高等真菌种类仅有500余种。与陆地真菌相比，有关海洋高等真菌保藏技术未见有专门研究。目前，海洋高等真菌菌种的保存并无成熟的方法，主要是参考陆地真菌的保存技术。

目前，针对陆地真菌的菌种保存方法有很多，主要有以下三类：(1)菌种定期移植培养，这是常用的保存方法，但是这种保存方法，微生物的生长和代谢活动没有受到任何抑制，所以存活时期较短，发生变异的可能性较大。另外，该方法保存菌种主要采用培养平板，培养基用量较多，因此浪费实验药品和占用较大空间，不宜大批量保存菌种。(2)低温和矿物油下保存，可以部分抑制生长和代谢活动，可延长菌种的存活期和减少变异。此种方法采用培养平板(培养平板放置在5℃低温条件下保存)或培养试管(培养试管中添加一定量的矿物油)保存菌种，同样面临浪费实验药品与占用较大空间的问题。矿物油下保存菌种的方法操作费事，在实际保存中添加的矿物油很难控制准确的量，一旦添加了过量的矿物油，极易导致保存的菌种因长期缺氧而失去活性。(3)采用真空干燥和冷冻干燥的方法，以及近年来发展的液态氮的超低温保存法，可以完全抑制代谢活动，效果明显提高。该方法需要较多的设备，不是一般实验室都能采用的。同时，由于在菌种复活转接期间要求的条件较为严格，而难以普及应用。

发明内容

本发明的目的是针对海洋高等真菌保存技术缺乏的现状，提供一种海洋高等真菌的大批量长期保存方法，以克服已有技术的不足。

本发明的特征是将需要保存的菌种转接到陈海水琼脂培养平板上，在15℃下培养一个月到一个半月，再将冻存管盐酸浸泡消毒后，用蒸馏水冲洗干净备用，然后用移液枪移取1.6ml的陈海水放入上述冻存管中，将盛有陈海水的冻存管进行高压蒸汽灭菌20分钟后取出备用，再用灭菌的手术刀在无菌环境下，切取直径小于冻存管管口径的一小块长有真菌的培养基块，并将其放入上述冻存管中浸泡在陈海水里，最后将冻存管盖螺紧装入冻存管盒内，于5℃、黑暗条件下保存。上述冻存管以浓度为5％的盐酸浸泡消毒。

本发明的菌种的复活转接方法只要用移液枪将冻存管中少量的陈海水转移到培养平板上即可。

上述的高压蒸汽灭菌的温度和压力分别为121℃，98.1kPa。

上述的陈海水琼脂培养平板是1000ml陈海水+15克琼脂粉。

上述的冻存管的容量为1.8ml。使用前，冻存管以浓度为5％的盐酸浸泡消毒。

本发明简便、易于操作，只需利用大多数实验室均能具备的冻存管，就能很好地解决目前海洋高等真菌保存过程中易出现退化、失活以及浪费实验药品、空间资源等问题。

具体实施方式

本发明的更具体的实施步骤：(1)制备陈海水：取天然海水避光保存3个月以上，使用时经0.45μm滤膜过滤，即获得陈海水。将需要保存的菌种转接到陈海水琼脂培养平板(1000ml陈海水+15克琼脂粉)上，15℃下培养一个月到一个半月(视真菌生长情况而定)。该陈海水琼脂培养基是贫营养条件的培养基，符合海洋高等真菌的实际生活环境，用以培养真菌，可以获得性状稳定、健康的真菌菌落，有利于延长保存时间。(2)选择容量为1.8ml的冻存管，盐酸浸泡消毒后，用蒸馏水冲洗干净。然后，用移液枪移取1.6ml的陈海水，放入冻存管中。(3)将盛有陈海水的冻存管进行高压蒸汽灭菌(121℃，98.1kPa)20分钟，取出备用。(4)用灭菌的手术刀在无菌环境下，切取一小块长有真菌的培养基(培养基块的直径应小于冻存管管口直径)，然后将其放入(3)步骤中获得的冻存管中，并浸泡在陈海水里，再将冻存管盖螺紧，装入冻存管盒内，放置于5℃、黑暗条件下保存。