[发明专利]HCMV－Towne－GFP重组巨细胞病毒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是在自然界普遍存在的一种疱疹病毒，是严重威胁新生儿健康的主要致畸病毒之一。由于近年来免疫抑制患者如骨髓移植、器官移植、艾滋病人的增多，巨细胞病毒感染日益受到重视。目前用于治疗HCMV感染的有效药物不多，而且常用的药物存在口服用药生物效价低，药效差，具有一定的毒性以及耐药毒株的问题。

随着医药基础理论的不断前进，基因工程技术的不断发展，新的抗病毒药不断出现。新的抗病毒药物的不断开发，自然需要快速有效的药物筛选方法。细胞病变效应法(CytopathicEffect，CPE法)是测定病毒生存情况的有效方法，常被用作药物抗病毒活性的体外检测模型，该方法结果是肯定的，但实验周期长，操作复杂。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，将绿色荧光蛋白基因插入到病毒基因组中，在进行抗巨细胞病毒的药物筛选时，可以通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，具有操作简便、结果客观可靠、快速有效等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，包括人类巨细胞病毒基因组和US9-US10位点之间插入有绿色荧光蛋白基因的PHM673质粒。

所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)细胞和病毒的培养：用含10％小牛血清的1640培养液，在37℃、5％CO₂孵箱中传代培养人胚肺细胞；将人巨细胞病毒Towne标准毒株接种于上述人胚肺细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；

(2)质粒的转化：用PHM673质粒转化感受态大肠杆菌细胞，得到转化子；然后进行质粒的中量抽提，在紫外分光光度计上测量获得的产物的DNA含量，并进行电泳鉴定质粒，然后进行质粒的纯化，获得纯化的PHM673质粒；

(3)病毒重组：①脂质体转染及转化克隆重组病毒的获得：脂质体转染24小时后去掉培养液，将0.2ml HCMV-Towne标准毒株加入细胞培养孔，32～35℃吸附1小时，增加培养基的体积至2ml，在5％CO₂、37℃孵箱中孵育24小时；换用含G418(200ug/ml)的选择培养基继续培养，以后每隔3天换一次选择培养基，用反复冻融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重组病毒空斑的纯化：接种人胚肺细胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺细胞，37℃、5％CO₂孵育8～12天，荧光倒置显微镜观察，将荧光阳性孔挑出，即为转染成功的重组病毒，转移至新的人胚肺细胞中增殖。

所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒在抗巨细胞病毒药物筛选中的应用：在进行抗巨细胞病毒的药物筛选时，用本发明的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒感染宿主细胞，然后在药物的作用下培养繁殖，检测绿色荧光蛋白的表达，即代表病毒的表达情况，以此来判断药物的作用，具有灵敏、快速、准确、有效的特点。

本发明利用分子生物学方法，构建了表达绿色荧光蛋白的巨细胞病毒，可应用于抗巨细胞病毒的药物筛选，通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，具有方法操作简便，结果客观可靠等优点，这也为药物的常规应用和试验研究开辟了一条新的途径，并可进一步用于巨细胞病毒发病机制和致畸机制的研究。

附图说明

图1为PHM673质粒的模式图；

图2为PHM673质粒的电泳图；

其中，I为λ-HindIII Marker，II1-II5为5个不同的转化子提取质粒后的电泳结果；II为PHM673质粒DNA用NheI酶切后的的电泳结果；

图3为HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒感染HELF后第3、5、7、9、11天的感染状态图；

其中，(A)为第3天，(B)为第5天，(C)为第7天，(D)为第9天(E)为第11天；

图4为野生型HCMV与重组HCMV-GFP通过PCR扩增后电泳鉴定结果图；

其中，A、B为重组病毒扩增产物，C为野生型病毒扩增产物，D为Marker15000；

图5为HCMV-Towne与HCMV-Towne-GFP子代病毒滴度的比较；