[发明专利]一种纯化干扰素蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及药用干扰素蛋白的纯化，特别涉及反相填料层析方法在干扰素的纯化中的应用。

背景技术

干扰素是一些结构相似，功能相近的低分子量糖蛋白质，具有共同的多肽成分，其分子量在15-40KD左右，其大小取决于它的糖基化程度。1957年Zssacs和Lindenmann首次发现受到病毒感染的细胞会产生一种物质，保护其他细胞抵御多种病毒素的感染，并命名为干扰素(Interferon，IFN)。干扰素具有很高的生物活性，1mg即具有10亿个活性单位。其抗病毒作用无特异性，由一种诱导剂诱导细胞产生的干扰素可抑制多种病毒的复制，是广谱的抗病毒物质。

根据干扰素的结构和来源可分为干扰素α，β，γ三种。干扰素α主要由单核巨噬细胞，B细胞，成纤维细胞产生，可分为23个亚型，不同亚型的干扰素α具有较高的同源性。干扰素β主要由成纤维细胞产生，由166个氨基酸残基组成，与干扰素α之间的同源性为25％，二者又称为I型干扰素。干扰素γ又称为II型干扰素，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，由143个氨基酸残基组成，它和I型干扰素之间没有明显的同源。

干扰素cDNA的获得是将产生干扰素的白细胞的mRNA分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母细胞，并测定干扰素的抗病毒活性。结果发现12smRNA的活性最高，因此用这部分mRNA合成cDNA。干扰素mRNA仅占白细胞总mRNA的0.101％～0.11％，因此转化的cDNA文库中大肠杆菌克隆多达上万个，每一个克隆都需检测是否含有专一的干扰素基因。大多数干扰素都是糖基化的，但糖链并非生物活性所必需。起初干扰素在大肠杆菌中的表达水平为每个细胞生产50个干扰素分子，将干扰素cDNA序列精确定位于E coli的乳糖启动子邻近，提高表达效率1000倍以上。目前1升培养液已得到1mg干扰素，并已纯化结晶，证明即使大剂量应用也无毒性。

干扰素的分离纯化技术有许多中，其中色谱法已被普遍认为是当前分离纯化生化样品最有效的手段。目前，大多采用离子交换层析和疏水层析色谱方法，如将复性后的干扰素经DEAE离子交换色谱，进行分离。选用以上色谱方法分离纯化工艺简单，成本低，但干扰素的纯度通常只能达到95％左右。有文献报道用亲和色谱或反相色谱，疏水色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等方法纯化蛋白。亲和色谱配体生产困难，费用高，且配体脱落影响产物纯度。而反相色谱(RPLC)与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。由于RPLC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等，纯化产物不必进行洗脱，因此大大简化了操作步骤。在RPLC中，蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用，从而表现出与其他色谱及电泳方法不同的选择性，提供其他方法不能提供的信息，这成为RPLC在蛋白质分离中有利因素。

本发明采用反相色谱填料对干扰素进行纯化，不仅使干扰素蛋白回收率达到满意的结果，还提高干扰素的纯度、比活，大大简化了操作步骤、缩短了生产周期，可以预料，由于设备的简化将会使投资成本大大下降，经济效益明显上升。

发明内容

本发明可解决现有干扰素纯化技术的不足，是对基因工程蛋白分离纯化手段的创新，大幅度提高干扰素分离纯化后的纯度、比活、稳定性。

本发明关键技术在于采用了反相填料的精细分离纯化步骤。包括步骤：

a、将工程菌进行发酵培养；

b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到粗品包涵体；

c、对粗品包涵体进行复性，获得复性产物；

d、对复性产物进行离子柱层析处理，得到离子柱层析产物；

e、离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到蛋白。

同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，干扰素电泳纯度由离子柱层析产物的90％提高到98％，HPLC纯度由90％提高到98％，其比活由0.9×10⁷IU/mg提高到3.5×10⁸IU/mg。4℃条件下稳定性由原有的3个月提高到12个月。可见，采用本发明的干扰素的纯化工艺，可以大幅度的提高干扰素蛋白的纯度、比活、稳定性。将降低干扰素在临床中的副作用。

具体实施方式

以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。

实施例1

使用半制备型MKF-RP柱。

样品：阳离子层析产物200ml，蛋白浓度2mg/ml。