[发明专利]交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒 温扩增靶核酸序列的方法。本发明还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序 列的方法及靶核酸序列的快速检测方法。

本发明还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原 微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。

背景技术

近30年来，全球流行病趋势表明，难培养和不能培养的病原微生物已经 成为传染性和感染性疾病的主要根源。一些常规的病原菌检测方法(例如， 大量增殖菌数、菌落纯化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴 定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经越来越跟不上人类对致 病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来 研究这些病原菌的核酸结构和分子特征，将对那些难以人工培养和不能人工 培养的病原微生物进行正确地鉴定起到重要作用，可以大大提高对病原菌的 检测和研究能力。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接检测 临床标本，在较短时间内得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛， 并有逐步替代传统的细菌或病毒培养的趋势。

聚合酶链反应(PCR)技术是目前最成熟的核酸扩增技术，自它问世以来， 该技术就得到了极为广泛的应用和发展。目前，体外核酸扩增技术可分为两 大类，一类如聚合酶链反应技术(PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)和转录依赖的扩增系统(transcription based amplification system，TAS)等，这类技术的共同特点是均要进行几个保温点的循环。第二 类是恒温扩增系统，如链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)，核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)，转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)，滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)， 连环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解 链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification，HDA)等。这类技术的 共同特点是扩增反应均在一个特定温度下进行，从而大大降低了对仪器的要 求。

由于目前各种体外核酸扩增技术大多需要与电泳、荧光、质谱法或直接 测序等方法结合来进行检测。这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是 以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此并不适合于在 基层医院进行广泛的应用和推广。本发明是结合了先进的恒温核酸扩增技术 和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、价格低廉的检 测技术。可以广泛地应用于所有与病原体检测等相关领域。下面就现有的主 要的几种扩增检测技术进行概述。

1、聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)

聚合酶链式反应是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两 侧，从而酶促合成多个拷贝的靶序列DNA片段。PCR的每一循环都包括DNA 变性，引物复性和由DNA聚合酶催化的延伸反应。每次循环新合成的DNA片 段又可成为下次循环的模板，这就导致靶序列DNA的指数扩增。目前，PCR 技术被广泛的应用到生物技术的各个方面。例如，对遗传疾病或肿瘤癌症的 诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断；用于亲子关系的鉴定 等。

2、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)

连接酶反应是基于Taq连接酶的连接能力的特异性，为了检出靶基因序 列中的点突变而设计的。连接酶反应识别点突变的特异性高于PCR，若靶序 列有点突变，则引物不能与靶序列精确结合，缺口附近的核苷酸空间结构发 生变化，则连接反应不能进行，也就不能产生扩增产物。目前该方法主要用 于点突变的研究与检测，如单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断， 微生物的种型鉴定和癌基因的点突变研究等。

3、滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)