[发明专利]检测结核分支杆菌和非结核分支杆菌核酸扩增产物的试纸与方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速识别是否存在结核分支杆菌和非结核分支杆菌的扩增DNA产物的试纸和方法。

背景技术

结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种引起肺结核病(Tuberculosis，TB)的细菌。结核分支杆菌大多攻击呼吸系统，但也可感染身体的其它器官、组织等。结核分支杆菌通过其携带者咳嗽、打喷嚏或说话等行为而通过空气传播。在2004年，统计数据显示有1460万人长期患病、有890万人是新增病例、有160万人死亡，这些人大部分分布在发展中国家。然而，因为免疫抑制药物的滥用或艾滋病的感染，越来越多的发达国家的人患上了肺结核。

非结核分支杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)不会引起我们所说的肺结核症状，且感染到非结核分支杆菌并不会传染，因此不会产生公共卫生问题。它不像结核分支杆菌引起的疾病，属于非法定传染病。然而，受非结核分支杆菌感染的组织，会引起与肺结核病相似的肉芽肿(granulomataformation)，进而导致干酪样坏死(caseous necrosis)。在直接涂片中，分支杆菌抗酸醇Ziehl-Neelsen染色呈阳性反应，故无法区别是结核分支杆菌或非结核分支杆菌。只有通过细菌培养，才能从它们特定的形态特征上加以区别。结果导致感染非结核分支杆菌的患者，经常首先被诊断出肺结核症状。只有当细菌培养约六周后，才发现诊断需修正，这段期间导致患者或医生治疗混乱。

快速正确地检测结核分支杆菌的临床样本，对于临床治疗及疑似病人的确认，都有越来越重要的作用。分子技术，例如结核分支杆菌特定DNA的PCR扩增，可能是一种最有前景的快速、精确和敏锐的诊断方式。

在加拿大专利第02223705号中，Jia Bei Zhu等揭露了检测核酸扩增最终产物的一步分析法，该方法是通过用免疫原分子或亲和配体化合物来标记用于DNA扩增的探针，以及利用预固定有两种不同抗体和/或配体的测试试纸来检测最终产物来进行的。

发明内容

本发明提供一种用于检测结核分支杆菌(TB)和非结核分支杆菌(NTM)的核酸扩增产物的检测试纸，其包括：(a)抗生物素蛋白-金释放区域(avidin-goldrelease region)和(b)测试带。本发明还提供一种检测TB盒NTM的方法，其包括：(a)扩增具有标记的引物的样本DNA；(b)用电泳缓冲夜混合扩增的DNA产物；(c)将所述检测试纸浸入所述混合物中；和(d)使所述混合物流向试纸的反应区。

附图说明

图1为本发明一个实施例中的设计图。

图2显示了引物的相对位置。

图3显示了不同比例的结核分支杆菌及非结核分支杆菌的效果。

图4显示了不同电泳缓冲液的效果。

图5显示了引物与试纸的特异性。

图6显示了TB/NTM二重PCR及巢式二重PCR的检测局限。

图7显示了当用TB/NTM巢式二重PCR扩增DNA时试纸的检测局限。

具体实施方式

肺结核的致死率与死亡率在传染病中列于首位。然而，由于结核分支杆菌与非结核分支杆菌的临床症状相似，传统的诊断方法不但耗时而且混乱。快速而精确的诊断分支杆菌菌属(Mycobacterial species)，可以帮助临床治疗并降低传染风险。本发明的试纸及方法为从检测分支杆菌提供了一种快速且简便的方式，而且可在同一张试纸上检出两种分支杆菌，例如TB和NTM。

本试纸是一片吸水纸，自左到右包括，抗生物素蛋白-金释放区域和有测试带的测试区。所述试纸还可以包括位于所述测试区之后的对照带。抗生物素蛋白-金释放区域被覆盖着连有抗生物蛋白的胶体金颗粒。另外，两种与下述免疫原标记引物相对应的抗体分别被预固定在两个检测带上，而结合有牛血清白蛋白(BSA)的生物素被预固定在对照带上。

本方法包含四个步骤。在第一步中，通过PCR，将一个链上含有生物素而另一链上含有免疫原分子例如DIG或FITC的特别设计的引物，用于扩增从病人体内获得的样本DNA。所述引物对应于一个靶标基因，例如rpoB基因，其包含高度保守区域，该区域存在于所有分支杆菌种类中但各种类间又是可区别的。扩增后，DNA产物被混合在电泳缓冲液中。在以下步骤中，测试试纸的左边浸入混合物，使得混合物利用毛细作用由左向右移动。