[发明专利]一种利用具有茎环样结构引物通过PCR制备单链DNA的方法

说明书

发明领域：

本发明涉及一种利用具有茎环样结构引物通过PCR制备单链DNA的方法，主要特征 是带有茎环结构的引物分子的使用，包括5’端的反向重复序列，GC含量以及二级结构； 涉及PCR反应条件；涉及发明中茎环结构的引物和PCR在单链DNA制备中的应用。

背景技术：

与RNA分子一样，单链DNA(ssDNA)结构灵活易变，三维结构复杂，很容易形成 与靶标结合的口袋结构，因此单链DNA寡核苷酸配基(aptamer)在分子识别、化学分析 及生物医药领域具有广阔应用前景。特别是在SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)技术研究与应用中，ssDNA的制备更是关键。SELEX技术 是通过反复将单链随机DNA文库与靶分子孵育、分离结合的单链DNA、PCR扩增，最终 获得高亲和力的与靶分子特异结合的ssDNA序列(aptamer)(Tuerk C，et al.Science 1990；249：505-510)。SELEX筛选的一个关键步骤是富集后单链DNA文库的再制备，将 PCR产生的双链产物中的负链去除，保留具有结合能力的正链。假设某一ssDNA文库中混 有dsDNA成分，那么随着筛选轮数的增加，文库中dsDNA的比例不仅会增加，而且能形成 稳定的双螺旋结构不与靶分子结合，最终导致特异性的ssDNA配基丢失，SELEX筛选失败。 除了SELEX筛选，其它生物医学领域也常常需要制备单链的DNA。因此，有效的ssDNA制备 方法将便利生物医学研究。

当前，制备ssDNA的方法很多，如：直接化学合成、RNA逆转录、不对称PCR、亲和素 标记磁珠分离等。但在实际应用中，这些方法均存在一些问题，例如：1、直接化学合成 法是方便简单，但是利用该法只能合成已知序列或事先设计好的随机序列ssDNA文库，对 于经SELEX筛选富集获得的未知序列不适用。2、不对称PCR制备单链产物时产物容易发生 弥散，原因可能与PCR体系离子强度、dNTP浓度等有关，特别是以经过数轮SELEX筛选后 的文库作为模板先PCR扩增成dsDNA，再经不对称PCR制备单链产物时更易出现弥散现象； 另外，不对称PCR在前10-15个循环通常都产生双链产物，因此这种方法制备的单链纯度 不高，存在互补负链干扰的弊端3、亲和素标记磁珠分离制备单链DNA时，生物素标记PCR 产物的负链，亲和素包被的磁珠分离的手段能获得高纯度的正链DNA，但该方法分离前需 要先纯化PCR产物去除生物素化引物的干扰，而且回收效率往往不能满足实验需求。磁珠 价格昂贵也是制约实验的一个因素；另外，如果下游实验要用到生物素标记的正链DNA， 则无法应用磁珠的方法制备单链；4、RNA逆转录制备单链DNA需要先将ssDNA转录成RNA， RNA分子容易降解造成配基的丢失，而且转录模板需要引入转录酶识别序列，这些序列如 果和ssDNA退火，便可能影响筛选，因此操作复杂不实用。

Kelly P.Williams(Nucleic acids research，1995，4220-4221)等介绍了一种新的利用特殊 引物PCR制备单链的方法，该反义引物由三个部分组成，5’端加长序列-终止子-互补序列。 互补序列与模板退火，发挥引物的功能；终止子为一个Taq酶不能穿越的非核苷酸物质， 六乙烯乙二醇(HEGL)分子，用于阻止正义链的延伸；5’加长序列为20个dA组成的聚A 尾巴，用于生成长链的PCR产物。因此，反义引物和模板退火并在Taq酶作用下会延伸产 生一个长于模板20个碱基的负链产物，而当正义引物以此反义链为模板延伸时，由于Taq 酶不能越过HEGL，正链的延伸因此终止，故正链的长度与模板一样。在变性的PAGE凝 胶上，两条链可以明显分开进而分离纯化单链DNA。这种方法在单链DNA的制备方面具 有明显的优越性，例如价格低廉、PCR一步获得等，但受修饰的限制，在合成引物时需 要HEGL修饰，很多公司不具备这种能力。单链的加长序列也可能会和模板区退火影响扩 增效率，尤其在体外筛选后期，随机区可能会含有多个dT等富集序列的情况时。