[发明专利]一种诱导神经干细胞定向分化的方法无效
申请号: | 200810132154.0 | 申请日: | 2008-07-21 |
公开(公告)号: | CN101705205A | 公开(公告)日: | 2010-05-12 |
发明(设计)人: | 王彦哲 | 申请(专利权)人: | 王彦哲 |
主分类号: | C12N5/06 | 分类号: | C12N5/06;A61P25/16;A61P9/10;A61P25/00;A61P25/28 |
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地址: | 110168 辽宁*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 诱导 神经 干细胞 定向 分化 方法 | ||
1.一种诱导神经干细胞定向分化的方法,其特征在于包括如下步骤:(1)成体干细胞系的建立,无菌条件取实验动物胚胎组织分离纯化获得的成体干细胞,经数十代至上百代的培养传代而建成不同的干细胞系;
(2)MSCS的定向诱导,更换培养液2天后换液并添加0.01~100mMOL/L的单唾液酸四己精神经节育脂,分别诱导;
(3)SCS和诱导细胞形态学观察;
(4)免疫细胞化学染色,诱导细胞分别用巢蛋白、NSE、GFAP抗体进行细胞免疫荧光染色。
2.根据权利要求1所述的一种诱导神经干细胞定向分化的方法,其特征在于(1)成体干细胞系的建立,首先分离从多种胚胎组织来源的成体干细胞,经纯化后在体外无血清条件下传代20~40代培养,建立包括造血于细胞、神经干细胞、肝脏于细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞等成体干细胞系;细胞要求生长状态良好,每3~4大传代一次,无细菌、支原体等污染;传代细胞需经细胞遗传学、克隆形成实验、裸鼠致瘤实验等的检测,证实其为正常生长状态的细胞;
(2)MSCS的定向诱导:更换培养液2天后换液并添加0.01~100mMOL/L的单唾液酸四己糖神经节着脂(GMI)分别诱导1,3,5,7,14,28天;对照组仅以含2%B27的Neurobasal培养液继续培养相同时间;
(3)MSCS和诱导细胞形态学观察:培养的MSCS经4-6次传代后基本除去非MSCS,此时的MSCs呈单层、贴壁、巢状趋势生长,胞体以长梭形为主,GDla染色阳性,经GMI诱导后细胞出长校形大胞体逐渐演变为小跑体、多突起细胞,其胞体折光性明显增强,部分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁,形态学证明为神经干细胞;
(4)免疫细胞化学染色:免疫细胞化学染色前细胞用4%的多聚甲醛固定并加PBS、于4℃保存;所有细胞染色均按相应试剂说明的方法进行;诱导细胞分别用巢蛋白、NSE、GFAP抗体进行细胞免疫荧光染色,特异性抗体标记显示诱导细胞为神经前体(干)细胞或神经细胞;
(5)诱导细胞移植治疗的临床应用:经诱导后的神经前体(干)细胞、神经细胞经静脉输注移植或脑内移植具有治疗帕金森病或综合征、中风及其后遗症、脊髓损伤及其后遗症、阿尔茨海默病(老年性痴呆)等作用。
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