[发明专利]用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列及其鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列及其鉴定方法。

背景技术

曲霉属真菌寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和黄曲霉(A.flavus)表型特征相近且都可产生严重致癌代谢产物黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全和危害人们身体健康的隐形杀手。

目前对寄生曲霉和黄曲霉的鉴定十分困难，主要采用传统的形态学方法，根据分生孢子梗的排列方式、分生孢子的形状、分生孢子壁的厚度和光滑程度及菌落在一系列培养基(察氏培养基(CZ)、黄曲霉鉴别培养基(AFPA)和椰浆培养基(CCA))上的颜色和形态来加以鉴定区分。

已有大量研究报道了产毒素黄曲霉菌株的检测方法，但从未报道过寄生曲霉和黄曲霉的分子鉴定方法。传统的鉴定方法费时、费力。

发明内容

本发明提供了用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，该引物特异性高，能够快速鉴定寄生曲霉和黄曲霉。

用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：4所述的碱基序列。

寄生曲霉和黄曲霉共有糖利用基因簇中的glcA基因序列，而其它真菌没有该基因序列，第一组引物就是glcA基因序列中部分序列，利用第一组引物对寄生曲霉和黄曲霉的基因组DNA进行PCR扩增，可得到745-bp的DNA片断，对其它真菌的DNA进行PCR扩增则不能得到任何DNA片断。

寄生曲霉能产生B1、B2、G1和G2四种毒素，黄曲霉只能产生B1和B2两种毒素，对产毒寄生曲霉和产毒黄曲霉的毒素合成基因簇进行研究发现，产毒黄曲霉中的毒素合成基因norB、cypA或它们两者之间的间隔序列发生缺失，而产毒寄生曲霉则含有完整的毒素合成基因簇。

如图1所示，产毒黄曲霉在norB和cypA间存在两种缺失类型(I和II)：

缺失类型I：产毒黄曲霉缺失norB的1-280位氨基酸、cypA基因的1-112位氨基酸以及norB和cypA的间隔区。

缺失类型II：产毒黄曲霉缺失norB基因的1-181位和300-310位氨基酸、cypA基因的1-29位氨基酸和norB和cypA的间隔区(如图1所示)。

第二组引物就是两种缺失类型产毒黄曲霉的共有缺失片段的部分序列，利用第二组引物对寄生曲霉基因组DNA进行PCR扩增，可以得到462-bp的DNA片段，对其它真菌或黄曲霉的DNA进行PCR扩增则不能得到任何DNA片断。

本发明还提供了一种利用上述引物序列鉴定寄生曲霉和黄曲霉的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测菌的DNA；

(2)以待测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；

(3)PCR产物凝胶电泳后用EB显色，根据凝胶上的DNA条带数量，判断待测菌的类型；

当DNA条带数量为2时，判定待测菌为寄生曲霉；

当DNA条带数量为1时，判定待测菌为黄曲霉；

当DNA条带数量为0时，判定待测菌为其它真菌或细菌。

本发明提供了用于鉴定寄生曲霉和黄曲霉的引物序列，该序列特异性高，通过利用该引物序列通过PCR扩增鉴定寄生曲霉和黄曲霉，速度快，可靠性高，为研究黄曲霉毒素污染的土壤或农作物中两种真菌的分布和动态变化奠定理论基础，进而为黄曲霉毒素的治理提供科学依据。

附图说明

图1为本发明引物序列在norA-cypB基因序列上的位置图谱；

图2为特异性检测中各菌株PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。

具体实施方式

所选菌株