[发明专利]香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇Cr02菌种进行鉴别和检测的方法。

(二)背景技术

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)起源于亚洲和澳洲的温带-亚热带地区。香菇以其营养、医疗价值和独特的口味而闻名全世界，特别是在中国和其它的东南亚国家。中国是最早栽培香菇的国家，目前香菇产量达到全世界的70％。香菇菌种是香菇生产中最重要的生产资料，目前在中国商业栽培使用的香菇菌种已超过100余种。在香菇生产中，一些具有高产优质栽培特性的香菇菌种通常在产业界被评价为优良菌种，例如在生产上一直栽培的Cr02、庆20、申8、香9菌种等。这些优良菌种在中国得到大面积栽培，甚至引种到了其他一些亚洲国家和地区如日本、韩国、中国台湾等，栽培者因此也获得了巨大的经济利益。然而长期以来，中国香菇主产地的菌种生产、销售一直较为混乱，“异种同名、同种异名”现象普遍存在，特别是一些优良菌种频繁被假冒而出现在菌种市场上，极大地损害了香菇育种者和生产者的利益。因而对于香菇工业，建立一种简便、快速、可靠的优良菌种鉴定技术尤为迫切。

分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)在上个世纪90年代已用于食用菌菌种的分类鉴定上，但这些标记用于香菇菌种的鉴定均不够理想。SCAR(SequenceCharacterizedAmplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的是建立香菇Cr02菌种的SCAR分子标记，提供香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，以及一种能对香菇Cr02菌种进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物5′-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3′；

上游引物5′-CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记为引物获得香菇Cr02菌种的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对香菇Cr02菌种进行PCR扩增，可获得1084bp大小的特异性片段。

本发明还涉及一种所述的分子特异性标记引物对香菇Cr02菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现1084bp的DNA条带，则待测菌种为香菇Cr02菌种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-AGGCAAACTGGTTCCATGATA-3′；

下游引物5′-CTGTGAAGTCATTACAGTCGC-3′。

所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer               终浓度为1×

dNTPs                      1mmol/L

MgCl₂                      2.5mmol/L

Taq DNA酶                  2.5U

上、下游引物               各1.25μM

模板DNA                    60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，54.5℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。