[发明专利]DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因与应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类健康。放射治疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一。然而， 放疗可导致肿瘤周围正常组织受损，从而导致严重的副作用。同时，部分肿瘤细胞 具有耐放射的生物学特性或在放疗过程中肿瘤细胞产生诱导耐受性，导致治疗效果 降低。目前，如何降低放疗剂量、提高治疗效果和减少肿瘤细胞耐受，即增强肿瘤 放疗的辐射敏感性已成为肿瘤研究领域的热点之一。

放疗对肿瘤细胞的杀伤效应主要是通过诱发其DNA双链断裂(DNA double- strand breaks，DSBs)，从而导致肿瘤细胞程序性死亡或坏死。出现DSBs后，细 胞会对其修复，以保证基因组结构的完整性，这也是肿瘤细胞抵抗放疗的主要机制 之一。DNA修复能力越强，对放射的抗性越突出。哺乳动物细胞对DSB损伤修复主 要有非同源末端连接(nonhomologous end-jioning，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)两条途径。DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)是NHEJ途径中重要的组成成分。该复合物由调节亚单位Ku70/Ku80 异源二聚体和催化亚基DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)组成。DNA-PKcs通过自磷酸化及磷酸化其他效应蛋白如XRCC-4、Artemis 等在DSB修复中发挥重要作用。另外，DNA-PKcs还参与细胞周期G₂期调控及细胞 凋亡和自吞噬死亡，还可参与V(D)J重组过程，维护端粒长度。近年来，研究表 明DNA-PKcs在多种类型癌组织细胞中普遍高表达，具有高转移特性和放化疗抗性 的癌细胞中DNA-PKcs的表达活性显著增高；特异性抑制DNA-PKcs导致细胞对γ射 线及紫外线的敏感性增加，DNA-PKcs表达沉默细胞的生长速度和接种裸鼠后形成肿 瘤的生长速度减慢，显示DNA-PKcs具有作为放射增敏抗癌分子靶标的重要价值。

目前已有多种方式用以抑制DNA-PKcs功能，如典型的PI3K抑制剂渥漫青霉素 (Wortmannin)、LY294002，特异的DNA-PKcs抑制剂OK-1035、NU7026，反义寡核 苷酸，单克隆抗体以及Ku片段等。然而这些抑制剂或特异性较差或用于机体可导 致肝毒性或引起免疫反应，限制其实际应用。

近年来人源抗体制备技术得到了快速的发展。由于这类抗体与人体本身产生的 抗体同源，不会或较少引发自身免疫反应，加之抗体作用的特异性，因而治疗性单 链抗体已成为目前发展最快的生物药物，迄今国外已有19个治疗性单链抗体被批 准上市，而针对恶性肿瘤的治疗性抗体更是开发最为活跃的领域。尤其通过噬菌体 抗体库筛选特异性单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)技术的完 善，为人源抗体的制备提供了更为有效的手段。噬菌体抗体技术是以噬菌体的基因 作为载体，用抗体基因与其融合，在噬菌体表面表达出抗体。其特点是将抗体基因 型和表型统一在同一病毒颗粒内，通过筛选有特定功能的蛋白，同时可获得相应的 编码基因。单链抗体(scFv)仅为完整抗体的六分之一，相对分子质量约为27kD， 由轻链可变区(VL)和重链可变区(V_H)之间通过14～15个氨基酸的连接肽(linker) 连接形成。具有许多优点如体积小，免疫原性低，不易引起人体排斥反应；无Fc 段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，成像清晰；穿透能力强，能有效穿透致 密的组织屏障；易于基因操作和基因工程大量生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA依赖蛋白激酶催化亚基单链抗体及其编码基因 与应用。

本发明所提供的单链抗体，命名为anti-DPK3-scFv，是氨基酸序列为序列表 中序列2自氨基末端第1-109位的多肽通过连接肽与氨基酸序列是序列表中序列2 自氨基末端第135-250位的多肽连接获得的融合蛋白。

其中，anti-DPK3-scFv具体可为如下a)或b)的蛋白：

a)其氨基酸序列为序列表中序列2；

b)将a)限定的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 能与DNA依赖蛋白激酶催化亚单位特异结合的由a)衍生的多肽。