[发明专利]HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒

权利要求书

1.表达HIV的Gag基因的重组表达质粒pGag，其构建方法如下：

以质粒pHIV-NL4-3为模板，以RRE-fNde：5’-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3’和RRE-r：5’-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3’为引物，扩增HIV的RRE序列；扩增产物经NdeI和HindIII双酶切后回收；用BglII和NdeI双酶切pHIV-NL4-3，回收含Gag-Pol基因的DNA片段；将上述两个片段与经BamHI和HindIII双酶切的整合表达载体pcDNA3.1(-)共同连接，得到表达HIV Gag和Pol基因的辅助质粒pGag-Pol；

以pGag-Pol为模板，以HIV-PRRT-DEL-F：5’-GAGTATGTAGATGGGGCAGCCA-3’和HIV-PRRT-DEL-R：5’-GAGAAGCTAAAGGATACAGTTCCTTGT-3’为引物，进行PCR扩增；扩增产物经5’磷酸化后进行自连，再使用酶切位点XhoI筛选得到重组表达质粒pGag。

2.一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因的重组表达质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒、表达HIV的Rev基因的重组表达质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒；

所述表达HIV的Gag基因的重组表达质粒pGag，其构建方法如下：

以质粒pHIV-NL4-3为模板，以RRE-fNde：5’-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3’和RRE-r：5’-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3’为引物，扩增HIV的RRE序列；扩增产物经NdeI和HindIII双酶切后回收；用BglII和NdeI双酶切pHIV-NL4-3，回收含Gag-Pol基因的DNA片段；将上述两个片段与经BamHI和HindIII双酶切的整合表达载体pcDNA3.1(-)共同连接，得到表达HIV Gag和Pol基因的辅助质粒pGag-Pol；

以pGag-Pol为模板，以HIV-PRRT-DEL-F：5’-GAGTATGTAGATGGGGCAGCCA-3’和HIV-PRRT-DEL-R：5’-GAGAAGCTAAAGGATACAGTTCCTTGT-3’为引物，进行PCR扩增；扩增产物经5’磷酸化后进行自连，再使用酶切位点XhoI筛选得到重组表达质粒pGag；

所述表达报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc，其构建方法如下：

用BamHI和PvuII双酶切质粒pUC19，回收209bp片段；用PvuII和EcoRI双酶切质粒pUC19，回收92bp片段；将上述两种片段混合，与经BamHI和EcoRI双酶切并脱磷的载体pEGFP-N1连接，得到重组质粒pEGFP-N1-lac；

用XbaI和NcoI双酶切含荧光素酶基因的质粒pG5Luc，切胶回收1656bp的Luc基因片段，Klenow处理后，与经SmaI酶切的载体pUC19相连，得到中间质粒pUC19-Luc；

用BamHI和EcoRI双酶切质粒pUC19-Luc，回收含有Luc基因的长1700bp的片段，连接到经EcoRI和BglII双酶切的含CMV启动子的质粒pEGFP-N1-lac上，得到质粒pEGFP-N1-lac-luc；

合成如下两条寡核苷酸序列：

5’-tatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtac-3’和

5’-cgtcgacgggcccgaattcggatccaagcttca-3’；

上述两条寡核苷酸经变性后退火，形成末端分别为NdeI和KpnI的linker；用NdeI和KpnI双酶切慢病毒载体pLenti6/V5gwLacZ，与上述linker连接，得到质粒pLenti-Link；

用NdeI和EcoRI双酶切质粒pEGFP-N1-lac-luc，回收含有CMV早期启动子和Luc基因的长为2056bp的DNA片段，连接到经NdeI和EcoRI双酶切的质粒pLenti-Link上，得到重组慢病毒质粒pLenti-Luc；

所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒pRev，其构建方法如下：

以质粒pHIV-NL4-3为模板，以Rev-rEco：

5’-CGGAATTCGGAGTGTATTAAGCTTGTGT-3’和Rev-fBam：

5’-AGGGATCCAAAGAGCAGTGGGAATAGGA-3’为引物，扩增HIV Rev基因；扩增产物经BamHI和EcoRI双酶切后插入到经相同酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，得到重组表达质粒pRev；

所述表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒为pVSV-G。