[发明专利]水稻细胞色素P450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留

说明书

技术领域

本发明涉及水稻细胞色素P450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。

背景技术

利用生物技术发展生态农药是现代农业研究的一个重要方向，可以缓解农民负担、减少生态环境污染和降低因大量农药残留造成的人类健康危害。细胞色素P450酶系是结合在内质网膜上含硫醇血红素的氧化酶。细胞色素P450超基因家族存在很强的生物多样性，广泛参与动植物的各类生命活动，比如生物分子合成、解毒和药物代谢途径。利用功能基因组学和生物信息学手段，研究整合生物代谢途径中的细胞色素P450家族的功能信息，研究预测与降解农药残留相关的水稻P450基因，将有利于生产我国自主性的生态农药。以信号受体和转录途径组分分析为基础可进行农用化合物设计，结合化学信息学方法，可鉴定用于杀虫剂和除草剂的潜在化学成分。

发明内容

本发明的目的是提供水稻细胞色素P450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。

本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该引物对是根据水稻细胞色素P450基因序列设计的，细胞色素P450基因命名为CYP81A6，其NCBI定位号为NP_001051342，NCBI基因号(GENE ID)为Os03g0760200，DBJ号为AK104825，TIGR号为LOC_Os03g55240，全长cDNA序列长度为2199个核苷酸，定位于第三号染色体从31,379,697bp到31,384,722bp，该基因编码的蛋白共有732氨基酸。CYP81A6基因的表达受除草剂的诱导，所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。

本发明的另一个目的是提供一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法。

本发明所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待测的植物培养基质的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0±0.05，待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。

所述的植物培养基质可为任何可培养植物的液体或固体基质，如培养液、土壤、蛭石等。

当所述待测的植物培养基质为液体时，可将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待检测的植物培养基质中6小时-24小时；当所述待测的植物培养基质为固体时，可将待测的植物培养基质用5ml/100ml二甲亚砜水溶液浸泡，收集浸出液；将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中6小时-24小时。进行所述移栽的水稻可处于二叶期-四叶期。所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。

通过本发明提供的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法，可初步鉴定植物培养基质中是否有除草剂残留，再结合现有的仪器分析方法可确定植物培养基质中是否有除草剂残留。

为了方便、快速辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留，本发明还提供了一种专用的荧光定量PCR试剂盒，该荧光定量PCR试剂盒包含一对引物，该引物对由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成。

本发明根据一个对多种除草剂具有明显应答特征的水稻细胞色素P450基因的基因序列设计了一对引物，用该引物对可辅助检测植物培养基质中是否有除草剂残留。利用本发明的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法可对植物培养基质进行初步筛查，将筛出的候选植物培养基质再用现有的仪器分析方法进行确定有无除草剂残留，可大大降低仪器分析的工作强度，使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简便。

附图说明

图1为水稻细胞色素P450基因，CYP81A6，在水稻基因组序列上的位置示意图及基因结构。

图2为CYP81A6基因在二氯喹啉酸的处理条件下表达变化。

图3为CYP81A6基因在多种除草剂的处理条件下表达变化。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

下述实施例中的水稻品种来自国家种质资源库。

实施例1、CYP81A6在基因组序列的定位及引物设计