[发明专利]一种病毒联合检测技术

说明书

技术领域

本发明是生物技术领域的一种病毒检测试剂盒制备方法。核糖核酸的提取、逆转录和扩增在同一个体系中完成，可用于DNA病毒或者RNA病毒的联合检测。

背景技术

自上世纪晚期逆转酶发现以来，核糖核酸(RNA)的研究和应用逐渐被人们所接受，在真核生物生物制品的开发和真核生物尤其是病毒的检疫检验领域得到了广泛的应用。核糖核酸的操作过程主要由核糖核酸的提取，逆转录和基因扩增三个步骤构成，由于操作步骤较多，核糖核酸的化学性质不稳定等因素的存在，实验失败或者检测假隐性的几率较高。尤其是在核糖核酸的提取步骤，对环境因素和人为因素的要求较多，虽然人们已经能够把逆转录和基因扩增过程一体化完成，但总体操作效果的改善并不明显。

在DNA操作水平，因为PCR操作过程中存在高热阶段，可直接完成细胞的破裂，人们可以以细菌、细胞、组织块甚至切片作为模板直接对细胞或者组织内的基因片段进行扩增，不过在进行微生物菌落扩增时，我们发现由于细胞壁等因素的影响，部分微生物会出现假阳性的结果，而在病毒和噬菌体扩增过程中尚未发现上述现象。而且在DNA操作水平，目前已经有厂家如NEB，TAKARA，北京天根等公司将DNA聚合酶、底物和缓冲液混合预制成反映混合物获得了成功，我们认为该方式同样适用于核糖核酸的操作。基于此，我们对实验方法进行了改进以简化操作流程，目前国内外检测领域尚未发现相关的报道。

发明内容

本发明涉及生物体系领域一种病毒检测试剂盒制备方法，由组织缓冲液和扩增体系构成，其特征是：扩增体系由耐热DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸、反应缓冲液和扩增用引物预混合按照制成为扩增体系，分装后备用；疫水或者组织提取液直接加入到扩增体系中混匀后可立刻进行扩增检测。

本发明涉及的病毒检测试剂盒制备方法所针对的对象可以使是DNA病毒或者RNA病毒；当检测对象为RNA病毒时，试剂盒中耐热DNA聚合酶选择具有逆转录酶活性的耐热DNA聚合酶，其中包括不限于TaqDNA聚合酶及其片断、TthDNA聚合酶及其片断、FD耐热逆转录酶(FD-TRT)及其片断，可选择其中一种或者几种的混合物，优选但不限于Taq DNA聚合酶，同时根据所选择酶系的工作特点选择逆转录酶活性和DNA聚合酶活性反应体系。

本发明涉及的病毒检测试剂盒制备方法中，反应缓冲液由缓冲体系，无机盐、非特异性蛋白质构成；当检测对象为RNA病毒时，反应体系中可加入或者不加入核糖核酸酶抑制剂，其中核糖核酸酶抑制剂包括但不限于非特异性核糖核酸，核糖核酸酶抗体。

本发明涉及的病毒检测试剂盒制备方法中，扩增用引物队可以含有一到四千对针对相同或者不同病毒基因的引物对，其中优选但不限于含有一到五对针对相同或者不同病毒基因的引物对；各引物对扩增产物的长度相差1到4000bp，优选但不限于100到500bp。

实施方案

1、构建扩增体系

1)选取适当的具有逆转录酶活性的DNA聚合酶系。

2)按照相关资料选用适合酶系逆转录活性和DNA聚合酶发挥作用的缓冲体系和离子组分配制反应缓冲液和样品缓冲液，并在其中加入或者不加入非特异性蛋白质、非特异性核糖核酸和核糖核酸酶抑制剂。

3)配制适当浓度的三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物

4)配制适当浓度的扩增引物对，引物对可以有一种到四千种，优选但不限于一种到五种；各引物对扩增产物的长度相差1到4000bp，优选但不限于100到500bp

5)在预制反应混合物方式中，将上述工具酶、反应缓冲液和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合，制成1倍到10倍浓度的预制反应混合物，优选但不限于一到两倍；低温混合完成后李可分装冷冻保存，其中可加入适量甘油。

2、样品检测方法

1)模板的制备：病毒载体可直接作为载体，加入到扩增体系中进行扩增；体外培养的动物细胞载体可热灭活后或者直接加入到扩增体系中进行扩增；体外培养的植物细胞或者动物组织需要加入样品缓冲液匀浆后，热灭活或者直接粉碎后加入到扩增体系中进行扩增。

2)目的基因的扩增：在预制反应混合物加入适量无菌水和模板；参照工具酶的工作特征设定工作程序进行扩增。

3)利用凝胶电泳或者叫磷酸检测体系确定扩增产物的含量，优选但不限于琼脂糖凝胶电泳检测体系。