[发明专利]一种双向筛选系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双向筛选系统及其应用。

背景技术

重组工程(Recombineering)是近年来兴起的一种基于λ噬菌体Red重组酶和体内同源重组反应的新型遗传工程技术，使用该技术不需要限制性内切酶和连接酶，仅需PCR扩增35-40bp短同源臂的线性DNA打靶片段即可在大肠杆菌体内对染色体DNA、细菌人工染色体(BAC)或普通质粒DNA进行高效精确的敲除、敲入、克隆和突变等修饰。Red重组系统包括Exo、Beta和Gam三种蛋白质，在可调控启动子控制下表达。Gam蛋白能抑制核酸酶RecBCD对线性双链DNA分子的降解；Exo是一种双链DNA依赖的核酸外切酶，能从5’端向3’端方向降解DNA，从而留下带3’突出的双链DNA；Beta是一种单链DNA结合蛋白，能结合在由Exo消化产生的3’端突出，防止DNA被核酸酶降解，同时介导互补单链DNA的退火和体内重组。

λ噬菌体Red重组酶介导的体内同源重组效率约为万分之一，需要进行大量克隆筛选才能获得重组子，通常利用抗菌素抗性基因作为筛选标记通过耐药性筛选，或者将loxP或Frt位点加在耐药性基因的两端，通过激活cre或flp重组酶的表达去除耐药性基因，但仍然会留下一个loxP或Frt位点。基因的单碱基点突变、阅读框架内基因的拼接融合等修饰要求不能留下任何筛选标记和多余的序列，因此，需要利用双向筛选标记精确地修饰基因而不会留下任何多余的DNA序列。

目前通常使用的双向筛选标记是利用一个抗生素耐药性基因(如新霉素)和sacB基因(neo-sacB)作为双向筛选标记，通过两步筛选来修饰DNA：第一步是将neo-sacB双向筛选标记敲入目的位点，进行抗生素耐药性筛选；第二步是将目的DNA敲入，用以替换neo-sacB，利用敲除neo-sacB基因的细菌在含7％蔗糖的M63培养基上能生长、而带有sacB基因的细菌在含7％蔗糖的M63培养基上不能生长来反向筛选阳性克隆。该方法的缺陷在于：sacB蛋白易于自发产生点突变，在反向筛选中会产生大量假阳性克隆，需进行大量筛选才能获得重组子。Nefedov等使用四环素抗性基因(tetracycline resistance gene，tet^R)作为反向筛选标记只能得到1％的阳性克隆(M.Nefedov，R.Williamson，P.A.loannou，Insertion of disease-causing mutations inBACs by homologous recombination in Escherechia coli，Nucleic AcidsRes，2000，28(17)：E79.)。Jamsai等使用EcoRI作为筛选标记，筛选效率为4％(D.Jamsai，et al.Insertion of common mutation into the human β-globin locus using GETRecombination and an EcoRI endonuclease counterselectioncassette.J.Biotechnol.2003，101：1-5)。Jamsai建立的新型I-SceI筛选标记会产生大于70％的假阳性背景(D.Jamsai，et al.Targeted modification of a humanβ-globin locusBAC colne using GET Recombination and anI-SceI counterselectioncassette.Genomics.2003，82：68-77.)。2005年，galK和thyA基因被报道用于双向筛选，具有较高的筛选效率(thyA基因的筛选效率大于90％)，但是只能在特殊构建的缺陷型宿主菌(ΔgalK、ΔthyA)中进行重组，需要使用添加脱氧葡萄糖或胸腺嘧啶的基本培养基(M9)筛选，细菌生长缓慢导致实验周期较长(Soren Warming，NinaCostantino，Donald L. Court，Nancy A.Jenkins，Neal G.Copeland.Simple and highlyefficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.4 e36.Queenie N.Y.Wong，Vivian C.W.Ng，Marie C.M.Lin，Hsiang-fu Kung，Danny Chan，Jian-Dong Huang.Efficient and seamless DNA recombineering using athymidylate synthase A selection system in Escherichia coli.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.6 e59.)。