[发明专利]一种定量检测PML/RARα mRNA水平的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测PML/RARαmRNA水平的试剂盒。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓性白血病中的一个特殊亚型。APL具有特异性细胞遗传学异常t(15；17)(q22；q12-21)，导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体上的维甲酸受体α(RARα)形成PML/RARα融合基因，其翻译产物PML/RARα融合蛋白可以阻滞粒细胞分化和成熟、同时异常早幼粒细胞凋亡不足，这是APL发病的主要分子机制。形成PML/RARα融合基因的RARα部分断裂位点均位于内含子2上，而PML上断裂位点有三类，根据PML上断裂位点不同将PML/RARα融合基因分为三种类型：(1)约55％的APL患者为BCR1型(L型)，PML断裂位点在内含子6上；(2)约40％的APL患者为BCR3型(S型)，PML断裂位点在内含子3上；(3)约5％的APL患者为BCR2型(V型)，PML断裂位点在外显子6上。采用RQ-PCR技术检测PML/RARα融合基因在APL的诊断及治疗过程中微小残留病(MRD)的监测具有重要的应用价值。

近几年发明的实时定量PCR技术(RQ-PCR)实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃。与普通PCR相比，RQ-PCR除了能够定量之外还具有以下优点：(1)通过在PCR反应体系中加入探针或通过制作熔解曲线，使特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。基于TaqMan探针的RQ-PCR技术关键之处在于：PCR反应体系中除了上、下游引物外还加入了TaqMan探针，该探针的5′端和3′端分别标有荧光报告基团(如FAM或TET)和荧光淬灭基团(如TAMRA)。PCR反应前，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭；随着PCR反应的进行，Taq酶发挥5’→3’的外切活性，使切下来的荧光报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号，荧光信号的强度与初始模板DNA的量成正比，当荧光信号强度大于阈值(基线以上10个SD)时，即可被荧光探测器定期实时监测，每个样本的CT值(PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数)与起始模板量的对数值成正比，可以根据CT值利用标准曲线分别计算出目的基因及内参基因的量，二者相除的比值即为目的基因的相对水平。

要计算出起始模板的量必须利用标准曲线，标准曲线的制作是采用经过系列稀释的已知起始量的标准品进行RQ-PCR，标准品可以是已知质量的cDNA或已知拷贝数的质粒，前者制作比较简单，但是得到的未知样品结果不直观，较难理解；而质粒标准品尽管制备比较繁琐，但是利用它可以计算出未知样品的拷贝数，且结果直观，是目前应用最广泛的标准品类型。

内参基因选择的目的是为了消除不同样本之间mRNA质量、数量以及逆转录效率等方面的差异，内参基因的选择有以下三大要求：(1)在所有有核细胞中均稳定表达，与分化系列及分化阶段无关，不受实验处理的影响；(2)不存在假基因；(3)表达水平及降解水平与目的基因一致。

急性白血病MRD监测手段包括：传统的细胞遗传学、FISH、流式细胞术和RQ-PCR。由于目前APL患者治疗后基本都能获得血液学及完全细胞遗传学缓解，因此MRD的监测主要依靠敏感而特异的RQ-PCR技术检测PML/RARαmRNA水平。MRD水平的确定是疗效评价、治疗方案的选择(如改变化疗方案、针对移植患者的供者淋巴细胞输注等临床干预措施)的重要依据，对于预防临床复发、提高患者缓解率、治愈率及生存率很有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测PML/RARαmRNA水平的试剂盒。

本发明所提供的定量检测PML/RARαmRNA水平的试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系和下述三种实时定量PCR体系中的至少一种：L-型PML/RARα实时定量PCR体系、S-型PML/RARα实时定量PCR体系和V-型PML/RARα实时定量PCR体系；