[发明专利]醌作为光度测试介质的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学检测样品中分析物的方法，以及适合该目的的检测试剂、试剂盒与测试元件。

背景技术

生化分析的测量系统是临床相关的分析方法的重要组成部分。在此情况下优选的是分析物的测量，所述分析物在酶的帮助下直接或间接地被测定。这样，分析物在酶-辅酶复合物的协助下被转化，然后量化，在合适的情况下，使用其它试剂。在这种情况下，待测定的分析物与合适的酶和辅酶接触，酶通常以催化剂量来使用。辅酶通过这种酶反应发生变化，如被氧化或还原。这个过程可以通过电化学和/或光度法直接或间接的检测。标定提供了测量与待测定的分析物的浓度的直接关系。

然而，现有技术已知的分析方法存在某些缺陷。因此，例如，大量用来对分析物进行光度检测的测试带(test strip)使用检测系统，所述系统利用葡萄糖-染料氧化还原酶(GlucDOR；EC 1.1.5.2)，一种PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶，作为酶。当在酶转化期间底物被氧化时，同时相应的辅酶发生还原反应。在辅酶PPQ(PPQ：吡咯并喹啉醌；4，5-二氢-4，5-二氧-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸)的情况下，还原发生至PQQH₂，其又能够转移电子至可还原的光学指示剂。这种系统的缺陷在于葡萄糖-染料氧化还原酶的低特异性，其不仅转化葡萄糖，同时还转化其它的糖类，如麦芽糖和半乳糖，因此，由于副反应，可能提供非常错误的结果。

NAD⁺依赖的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)是一种在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)存在下，催化葡萄糖氧化为葡糖酸-δ-内酯的酶，并且，该酶对葡萄糖的特异性明显强于葡萄糖-染料氧化还原酶。因此，在比色杯测试中(或者在湿化学法测试中或者在溶液中)，葡萄糖脱氢酶除转化葡萄糖之外，还转化程度仅仅分别为15％的木糖以及8％的甘露糖，然而半乳糖以及果糖不是这种酶的底物(Tietz Textbook of Clinical Chemistry，W.B.SaundersCompany，第2版，1994，编辑C.A.Burtis，E.R.Ashwood，第964-965页)。

NADH，在葡萄糖被葡萄糖脱氢酶氧化的过程中由NAD⁺还原形成的，仅仅具有低反应性，未直接被可还原的光学指示剂(例如磷钼酸或4-亚硝基苯胺)转化。为了消除NADH的这种低反应性，实践中采用增加辅酶反应性的介质。已知的介质的实例是心肌黄酶(EC 1.6.99.2)或者不稳定的N-甲基二甲基苯基吡唑酮鎓硫酸甲酯(N-methylphenazonium methosulphate)。

WO 99/19507公开了菲哕啉醌在分析物的电流检测中作为介质的应用。这样，待用于分析物研究的样品被施加到电化学测试条，所述电化学测试条包括载体、工作电极、参考/反电极以及传导元件，分析物在烟酰胺辅酶以及介质的存在下借助于烟酰胺依赖的酶而被氧化，测量电流，其是氧化还原被还原的介质所需要的，与分析物浓度相关。

WO 2004/038401A2涉及用于样品中分析物(例如，葡萄糖、3-羟基丁酸盐(3-hydroxybutyrate)以及乳酸盐)浓度的电流检测的生物传感器，采用WO99/19507所描述的电化学测试条。使用的介质是1，10-菲哕啉-5，6-醌，其与过渡金属离子(如镁、铁、锇等)或较重的碱土金属离子(如钙、钡等)结合以保护其不受氧气侵害。

WO 99/19507以及WO 2004/038401A2所描述的方法的缺陷在于电化学测试元件的使用，该方法不容许任何在分析物的定性或定量检测期间借助于比对颜色的目测检查实测结果的似真性。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种检测样品中分析物的方法，其确保简单及成本有效性的过程，同时，确保高选择性以及测量可靠性。

根据本发明，这个目标通过一种光学检测样品中分析物的方法实现，包括以下步骤：

(a)样品与检测试剂接触，检测试剂包括烟酰胺依赖的氧化还原酶，可还原的烟酰胺辅酶，为醌的介质，可还原的光学指示剂或可还原的光学指示剂系统，

其中分析物被烟酰胺依赖的氧化还原酶氧化，烟酰胺辅酶被还原，被还原的烟酰胺辅酶的电子由介质转移至光学指示剂或者光学指示剂系统，并且

(b)通过光学检测指示剂或指示剂系统来测定样品中的分析物的存在和/或数量。