[发明专利]胶体金免疫层析法的增敏检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大分子物质检测方法，特别是涉及生物大分子物质金标免疫层析检测的 增敏方法及利用其制作试剂盒的方法。

背景技术

目前，能够对生物大分子物质进行简便、快捷、高选择性与高灵敏度的检测，始终是人 们努力的方向，此在疾病的快速诊断、卫生检疫、动植物检疫、食品安全检测、环境监测等 领域都具有重要意义。其中，基于抗原抗体特异性反应的免疫分析法(Immunoassay)因其具 有极高的选择性和便捷性，同时其原理简单、不需大型实验设备或较大投资即可生产使用、 平均样品测试成本远低于仪器分析方法等特点而使其成为诸多特定物质检测的首选手段。

氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如柠檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸等作用下，聚合成为 特定大小的金颗粒，由于静电作用形成稳定的胶体状态，故称胶体金。由于胶体金表面带负 电荷，可以与蛋白质等大分子的正电荷因静电吸附而牢固结合，同时不影响蛋白质的生物特 性。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫分析法，形成了免疫金标记技术(Immunogold labeling techique)，即将胶体金作为示踪物应用于抗原抗体标记，主要以硝酸纤维素膜为载体 实现免疫检测。免疫金标记技术主要分为两种模式：(1)免疫渗滤分析(Flow through-immunofiltration assay，IFA)：免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜 而进行的(flow through type)；(2)侧流免疫层析分析(Lateral flow-immunochromatographic assay，ICA)：分析原理与IFA相同，只是反应液体的流动不是直向的穿透流动，而是通过 毛细管现象而发生层析作用的横向流动(lateral flow type)，在1990年开始应用。

上述两种方法虽然都是以硝酸纤维素膜为载体的免疫金标技术，但其检测原理有较大区 别。主要表现在：ICA加入试液后，在毛细管作用下试液层析扩散而实现了样本基质分离， 检测线中几乎不存在样品基质干扰；而IFA靠垂直穿透的洗涤，检测斑点易扩散，难于辨认 结果。所以，广泛使用的商品化试纸条(或试剂盒)产品大多采用免疫层析原理。

然而，免疫金标记检测方法的最大不足为检测灵敏度低，限制了实际应用范围。以往人 们主要利用银染色技术以克服检测灵敏度低的问题。即用硝酸银和特定还原剂作为信号放大 试剂来处理样品垫上的检测线。然而，该法信号放大效果不明显，主要因为检测信号本底模 糊、背景颜色高，不易通过肉眼判断检测结果。因此目前几乎难以见到基于银染色技术的胶 体金免疫层析产品。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种胶体金免疫层析法的增敏检测方法，此方法是在常 规胶体金免疫层析测定方法的基础上，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规胶 体金免疫层析法得到的检测线进行处理使信号增强，能显著增强常规胶体金免疫层析法的检 测信号且背景干净、本底值低，可提高检测灵敏度8～200倍，从而克服了传统胶体金免疫层 析检测方法灵敏度低的问题。

本发明的另一个目的是提供一种胶体金免疫层析高灵敏度检测试剂盒的制备方法及其产 品和应用，此试剂盒是利用上述胶体金免疫层析法的增敏检测方法来制备的。

一种用于胶体金免疫层析法的信号放大试剂，其为增敏试剂A和增敏试剂B按1∶1～1∶ 5的体积比混合的混合试剂，所述增敏试剂A为重量百分比浓度为0.1％～10％的氯金酸溶液， 增敏试剂B为还原剂溶液。其中所述还原剂溶液较好为摩尔浓度为0.1～10mM的盐酸羟胺溶 液或重量百分比浓度为0.1～0.5％的抗坏血酸溶液，也可以为其它还原剂，如柠檬酸三钠、白 磷、鞣酸等。其中所述氯金酸溶液的重量百分比浓度优选为1～4％。其中所述盐酸羟胺溶液的 摩尔浓度优选为2～6mM，或抗坏血酸溶液的重量百分比浓度优选为0.15～0.3％。

一种胶体金免疫层析法的增敏检测方法，在常规胶体金免疫层析法检测待测样本时，在 加入待测样本后再在金标抗体层和检测线之间添加所述的信号放大试剂10～80μL，对常规胶 体金免疫层析法得到的检测线进行处理使信号增强，室温下反应1～10分钟后，观察结果。