[发明专利]构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法

权利要求书

1.一种构建基因工程菌发酵联产PDO、BDO和PHP的方法，其特征在于：在产生PDO的克雷伯氏菌野生菌里敲除D型乳酸脱氢酶基因、引入辅酶A依赖性的醛脱氢酶和聚羟基脂肪酸合酶基因，构建发酵联产PDO、BDO和PHP的基因工程菌；采用将甘油和碱溶液进行混合流加的发酵调控方式；以及将发酵液经膜过滤，电渗析、浓缩、精馏步骤分离出产品PDO、BDO和PHP的产品提取流程；

其中，所述的PDO为1，3-丙二醇，BDO为2，3-丁二醇，PHP为由单体是β-羟基丙酸聚合生产的聚合物聚β-羟基丙酸，即Polyhydroxypropionic acid。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的基因工程菌的构建包括：D型乳酸脱氢酶基因的敲除，PHP重组质粒的构建；

(1)D型乳酸脱氢酶基因的敲除工艺步骤为

产生PDO的克雷伯氏菌野生型菌株基因组DNA的提取并纯化；

以纯化的基因组样品为模板，根据D型乳酸脱氢酶基因设计引物，进行基因扩增；

把基因扩增产物D型乳酸脱氢酶基因片段纯化后与克隆载体连接，所述的克隆载体为pMD18-T vector；

筛选阳性克隆载体并进行酶切，回收、连接自杀载体，然后转入大肠杆菌感受态细胞；所述的自杀载体为pGPKm或pGP704，所述的大肠杆菌为SM10；

含有重组质粒大肠杆菌与野生型宿主菌株进行双亲交换实验，使用自杀载体上面的抗性基因作为筛选标记，筛选出D型乳酸脱氢酶基因缺失的菌株；

(2)PHP重组质粒的构建的工艺步骤为：

以产生PDO的克雷伯氏菌野生型菌株基因组为模板克隆辅酶A依赖性的醛脱氢酶基因，经酶切、连接表达载体pDK6构建重组表达载体PAD_pDK6；

把来源于罗尔斯顿氏菌属的聚羟基脂肪酸合酶基因片段与PAD_pDK6连接构建重组载体PAD_PhaC_pDK6；

把PAD_PhaC_pDK6重组载体转化到步骤(1)中所构建的敲除了D型乳酸脱氢酶基因的工程菌感受态细胞里，鉴定并分离出阳性克隆为目的菌株。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的构建发酵联合生产PDO、BDO和PHP的基因工程菌是利用所构建的基因工程菌发酵联产PDO，BDO，PHP；其工艺为：将所构建的基因工程菌在固体培养基上培养16～24h，接入种子培养基30～37℃有氧培养，以1％～5％的接种量接入以甘油为发酵底物的发酵培养基；发酵温度30～37℃，发酵过程中通入空气，通气量0.1-2vvm，搅拌转速50-500rpm；发酵过程中根据所构建基因工程菌的特点，采用将甘油和碱溶液1∶0.05～1.0进行耦合流加的调控方式进行发酵，pH值控制在5.0～8.0，40～60h后停止流加至发酵结束。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的产品提取流程为：发酵液经过微滤和超滤，滤液经电渗析脱盐，脱盐后富含PDO、BDO的淡室液经浓缩、精馏步骤分离出产品PDO和BDO；过滤所得菌体用于提取PHP；另外来自电渗析的富含盐的浓室液经浓缩结晶得到丁二酸钠有机酸盐，作为产品之一，结晶母液又回到电渗析前。