[发明专利]一种磷酸转移酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

呈味核苷酸是继谷氨酸钠(MSG)之后，助鲜效果更明显、效率更高的新一代食品助鲜剂，被广泛应用于食品加工领域。呈味核苷酸与谷氨酸钠按一定比例混合使用时产生协同效应，使食品的鲜度提高数倍至数十倍，可使相同鲜度的助鲜产品成本降低40-60％。因此，作为食品的新型助鲜剂，呈味核苷酸的研究与应用引起了国内外的广泛重视。

呈味核苷酸的呈味作用取决于其化学结构，只有核苷的5′位磷酸酯化才具有呈味作用[Yoshikawa，M.，T.Kato，and T.Takenishi.Studies ofphosphorylation.III.Selective phosphorylation of unprotected nucleosides.Bull Chem Soc.Jpn，1969，42：3505-3508.]，2′、3′位磷酸酯化没有呈味作用。因此，目前有关生产呈味核苷酸工艺的研究，都是围绕着如何使核苷的5′位特异磷酸酯化。5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸为代表性的呈味核苷酸，5′-肌苷酸二钠和5′-鸟苷酸二钠的结构如下：

5′-肌苷酸二钠(5′-IMPNa₂)          5′-鸟苷酸二钠(5′-GMPNa₂)。

从上世纪60年代日本开始实现核苷酸工业化生产以来，经过几十年的研究，已经有多种生产核苷酸及其衍生物的方法。核苷酸的生产技术可分为以下三大类：核酸酶解法、直接发酵法及核苷发酵-合成法。

一、核酸酶解法

核酸酶解法是历史最长、最成熟的生产呈味核苷酸的方法。利用桔青霉的5′-磷酸二酯酶与从酵母中提取的RNA反应，可得到四种5′-核苷酸的混合物。经离子交换树脂分离纯化，得到四种核苷酸产品。为提高酶反应的速度及操作性能，可以采用固定化酶或膜反应器工艺。虽然核酸的酶解方法反应简单，但生产的核酸产物是混合物，要进一步得到5′-肌苷酸，需要将混合物进行分离纯化，并对5′-AMP进行化学修饰或酶法转化，才能得到5′-IMP。该方法分离纯化操作复杂，占地面积大，整体生产效率较低。

二、直接发酵法

直接发酵法生产核苷酸主要利用微生物代谢直接从简单的碳源和氮源生产5′肌苷酸或5′黄苷酸。直接发酵法生产肌苷酸的菌株主要有产氨短杆菌(B.ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(C.Glutamicum)、嗜醋酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)等。直接发酵法的生产菌株选育比较复杂。生产肌苷酸需要ATP的参与和再生，代谢途径控制难，产生的肌苷酸易于被继续分解。解决或解除终产物的反馈调节要比利用中间产物的代谢调控复杂得多，这一问题也限制了直接发酵法生产肌苷酸的工业应用。

三、核苷发酵-合成法

核苷发酵-合成法由发酵法生产核苷和磷酸化制备核苷酸两步工艺组成。先利用简单的碳源和氮源发酵生成核苷，再通过微生物酶的磷酸化反应，得到相应的核苷酸，其技术的关键问题在于如何将发酵生产的核苷高效地转化为目的核苷酸。核苷的磷酸化反应，可以通过化学转化和微生物酶转化来实现。

化学转化法可以将核苷进行磷酸酯化反应从而生成核苷酸，它是目前工业上常用的生产工艺之一。要利用化学法在核苷的5′位上导入磷酸基，得到5′-核苷酸，必须在磷酸化反应之前，使用适当的保护剂，保护核苷上碳2′和碳3′位的羟基不参与反应，然后在磷酸化反应结束后脱去保护剂。常用的核苷磷酸化试剂主要是磷酸或者焦磷酸衍生物，包括对三卤氧化磷，焦磷酰氯、双-对硝基苯焦磷酸等，而目前工业上广泛采用的是三氯氧化磷。由于化学法所用的试剂较昂贵，许多化学药品具有剧毒(如三氯氧化磷)，安全控制难度大，工艺要求高，环境污染严重，生产成本偏高。因此化学合成法一般用于生产一些有特殊用途的核苷酸的衍生物。

微生物中存在的核苷磷酸化酶可以不利用ATP将无机磷酸根特异的转移到核苷分子的特定位置上，具有反应条件温和、反应速度快、位置特异性强、转化率高、环境友好等特点，而且和传统的核酸酶解法及直接发酵法相比，催化过程简单，不需要ATP参与，过程控制容易，在呈味核苷酸的生产方面具有重要的应用价值。主要问题是ATP再生过程细胞膜通透性的控制，系统稳定控制难度较大；反应副产物多，不利于产品的分离纯化；只能进行批式反应；反应需要的时间长；转化率还有待于提高。