[发明专利]无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究、药物发现与开发领域，特别涉及一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片及其制备和检测方法。

背景技术

生命科学已进入后基因组即蛋白质组学时代，对基因表达产物——蛋白质的研究正成为热点，其包括蛋白质的结构与功能及其相互作用的研究，尤其是一个细胞、一种组织乃至一个个体中的全部蛋白质表达谱。一个基因至少可以表达5个蛋白质，最多可以表达20多个，蛋白质的数量要比基因多得多；一个细胞中有成千上万种蛋白质，一种组织中就更多，从而要求有更高的检测通量。基因芯片已成为基因组研究的技术平台，同时也为蛋白质组学的研究提供了借鉴，蛋白质芯片正逐步成为蛋白质组分析的重要技术平台。制备阵列芯片，探针的提供极为重要。基因由4个碱基组成，互补配对，相对稳定，用PCR法就可以获得大量的探针，足以满足制备基因芯片的需要。蛋白质却不然，它由20种氨基酸构成，目前还无法用人工合成的方法获取大量探针，只能从生物体中通过分离和纯化得到，获得的样品不仅种类很有限，而且数量也很小，难以满足制备阵列蛋白质芯片的要求。如何获得丰富的特异识别分子已成为蛋白质芯片制备亟待解决的一个难题。还需强调，蛋白质具有复杂的空间结构，标记法检测有可能会影响蛋白质的活性和结合位点，因而如何实现无标记高灵敏度检测也是蛋白质芯片技术所面临的另一难题。

自然界中最典型的具备特异识别能力的分子是抗体，抗体常被作为蛋白质芯片的探针。20世纪90年代兴起的噬菌体展示技术(phage display)已成为大量获得抗体的一种新手段，其原理是将编码抗体或抗原的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中，使其与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面。目前，已利用噬菌体展示技术来构建抗体库，库容量可达109以上，还可根据需要从库中淘选出对某种蛋白质特异的噬菌体抗体克隆，用于制备各种噬菌体展示蛋白质芯片。可见，噬菌体展示蛋白质有可能成为制备蛋白质芯片的各种各样探针的来源。噬菌体展示常用pIII和pVIII这2个系统，其中pVIII系统可展示上千个拷贝的蛋白质，常用于作为酶联免疫检测(ELISA enzyme-linked immunosorbent assay)、石英微量天平(QCM，Quartz crystal microbalance)以及荧光标记检测的探针。然而，ELISA和荧光标记法都需要对样本进行标记，QCM法不需标记，但是存在检测可靠性不高的问题，3种检测方法都不理想。pIII展示蛋白只有几个拷贝，但特异性强，可进行高亲和力筛选。因此，能否将pIII展示蛋白作为探针来制备阵列芯片，成为本发明的出发点之一。

表面等离子体共振(surface plasmon resonance，简称SPR)传感是一种高灵敏度的光学检测方法，可以对分子间的相互作用进行无标记的实时检测，已广泛应用于DNA-DNA，DNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质之间的相互作用。可是，目前其传感芯片上固定的探针都是生物分子，噬菌体却很大，常用作噬菌体展示技术的丝状噬菌体长约900nm，直径约6nm，显然现有的小分子或大分子固定方法不适用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种新的无标记噬菌体展示蛋白质芯片及制备和检测方法，可以实时获取噬菌体展示蛋白质与效应物相互作用的信息。

本发明的技术方案如下：

本发明的无标记噬菌体展示蛋白质芯片，其特征在于：该蛋白质芯片从下而上依次包括玻璃基片、铬膜、金膜、耦联层和噬菌体，所述耦联层为一层HS-(CH₂)₁₀-COOH自组装分子膜，所述的自组装分子膜一端为巯基，以金-硫键与所述金膜共价连接，另一端为羧基，与所述的噬菌体外壳蛋白pVIII上的氨基共价连接；所述的噬菌体为丝状噬菌体，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示多肽段或蛋白质，或在噬菌体的外壳蛋白pVIII上展示多肽段或蛋白质。

本发明所述的铬膜厚度为2～3nm；金膜厚度为40～55nm。

本发明所述的玻璃基片为6×6～20×20mm²的方片，厚度为0.8～1.2mm，材料采用折射率为1.5～1.8的光学玻璃。

本发明提供了一种无标记噬菌体展示蛋白质芯片的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)先在玻璃基片的一个表面上蒸镀或溅射铬膜，再在铬膜上蒸镀或溅射金膜；