[发明专利]以细胞内连接为基础的定向基因重组技术

说明书

技术领域

本发明是生物技术领域的一种定向基因重组技术。

背景技术

自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术已经建立了一套完善的体系，其中主要主要包括目的基因的分离，目的基因和表达载体的切割，目的基因与表达载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定向连接是传统重组技术的核心。

目的基因和载体的切割和连接是其中操作作为最为繁琐，工作周期最长，并且失败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等，但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。

目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的：

1、模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统等，FA斯图尔特等申请的专利技术——应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(中国专利申请号00812739.5)等。自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。自然重组技术需要载体末端和目的基因末端之间存在20～40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，从而使基因重组的操作成本提高了50～100倍。而且同源重组是一个动态的过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在普通实验室推广使用。

2、以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上建立的的USER Friendly系统等。常规的体内连接方式一般需要目的基因和载体之间具有9～12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，成本是传统技术的10～20倍；常规体内连接技术中互补配对载体必须具备一段很长的游离单链序列，在反复冻溶过程中很容易出现碱基脱落，影响连接效率，不适合长期储备或者工业化生产。

上述技术分别从不同的角度改良了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过高或者连接效率过低等因素的影响，上述技术并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。本发明对体内连接技术进行了改进，但是在特定载体构建过程中载体为原始载体或者平滑末端载体，重组载体容易保存，可经受反复冻溶，全过程在一个工作日内即可完成。

发明内容

本发明涉及生物技术领域一种新的定向基因重组操作技术，由重组载体，目的基因、定向配对复合物和宿主细胞构成；重组载体和目的基因两端含有2～12bp的同源序列，利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失时产生的选择性核酸外切酶活性消化目的基因和载体，产生互补序列并互补配对。配对产物直接转入宿主细胞，通过宿主细胞内部的相关酶系进行连接。该技术对基因内部序列没有要求。

实施方式

1、制备定向重组载体

1)重组载体可以选用但不限于质粒、噬菌体或者病毒载体

2)在重组载体重组载体中引入两个定向同源序列；定向同源序列由任意两种或者三种碱基构成的碱基序列构成，优选但不限于由G、C或者G、C加上另外一种碱基构成定向同源序列，长度2到12bp，优选4到8bp；两个定向同源序列之间含有限制性内切酶酶切位；酶切位点两侧序列不同而且不能互补，定向同源序列总长度可选择但不限于2～12bp。

3)对载体中引入的酶切位点进行酶切处理

4)对载体进行或者不脱末端修饰处理，修饰方式优选但不限于末端脱磷酸化修饰。

2、制备目的基因

1)合成分别具有载体上下游定向同源序列同源部分的上下游扩增引物。

2)目的基因的扩增，按照常规方法扩增目的基因，优选但不限于Pfu DNA聚合酶。

3)目的基因鉴定，通过常规琼脂糖电泳鉴定。

4)目的基因提纯，去除PCR体系中残余的dNTP和引物。

3、定向匹配

定向匹配体系由T4DNA聚合酶，dNTP，和反应缓冲液组成的定向匹配复合物。

方案一

1)将由重组载体和目的基因按照数量比为6∶1～1∶6的比例混合，推荐但不限于按照1∶3的的比例混合。