[发明专利]以连接后筛选为基础的定向基因重组技术

权利要求书

1 本发明涉及生物技术领域一种新的定性基因重组技术，由定向重组载体，定向目的基因和定向连接复合物构成。

2 根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是：两种定向重组载体均来源于质粒，粘粒，噬菌体或者病毒载体。其中一种定向重组载体具有能够与目的基因相连接的粘性末端或者平滑末端，其中一侧或者两侧末端含有半酶切位点，与目的基因反向连接后能够形成一个或者两个完整的酶切位点。另外一种定向重组载体含有一个或者两个酶切位点，在经过相应限制性内切酶切割后能够与反向连接的目的基因组成完整的限制性核酸内切酶酶切位点。

3 根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是：定向目的基因为PCR产物或者限制性核酸内切酶切割后的产物。定向目的基因两侧含有一个或者两个半酶切位点，能够与定向重组载体进行正向或者反向连接。反向连接时两个连接点形成一个或者两个完整的限制性核酸内切酶内切酶酶切位点，在正向连接时两个连接点不能形成相应的限制性核酸内切酶酶切位点。

4 根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是：定向连接复合物由DNA连接酶和限制性核酸内切酶联合构成。其中限制性内切酶能够特异性识别权利要求(2)(3)中所述的反向连接时形成的完整酶切位点并进行切割破坏，而对正向连接产物不能识别其连接点，对其不能构成破坏。定向连接复合物可以是两类工具酶同时参与反应形成的混合物，也可以是先使用连接酶，后使用限制性核酸内切酶形成的功能上的复合物；其中限制性核酸内切酶也可以该工具酶本身，也可以是该工具酶的表达菌株。