[发明专利]含有人源原癌基因c-Ha-ras的转基因小鼠的制作方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及制作癌症转基因动物模型的方法；该动物模型在多种癌症的癌变机理研究、致癌物或抑癌物的筛选研究、药物的临床前安全性评价研究中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细胞、组织、器官及胚胎及其在上述领域中的用途。 

背景技术

自80年代初首例转基因小鼠诞生以来，已经建立和发展了较多的基因导入方法，包括显微注射、反转录病毒介导的基因转移、胚胎干细胞技术、核移植技术、基因敲除(敲入)技术与RNA干涉，以及精子载体等，并由此也产生了众多专利(美国专利：US6576811B1，2003)。 

其中，因为其稳定性和成功率较高，显微注射方法成为转基因的最为常用的方法之一。它是将含有重组DNA的溶液直接注射进入胚胎中，在多数情况下，是将DNA注射到雄性前核中。在精制用于显微注射的DNA溶液时，一般采用酶切、回收目的DNA片段，凝胶DNA纯化等步骤获得纯净的DNA样品。合适的显微注射针和持定针是把DNA成功注射入0.5天的胚胎雄性前核的关键。胚胎的质量也是转基因成功的关键，良好的胚胎形状规则，饱满。 

把经显微注射的胚胎移植到假孕母鼠受体是一项技术性强但很直接的一项外科技术，它的全套操作必须做到无菌，快速和灵巧。待假孕鼠怀孕生仔后，通过剪取幼仔尾尖或者通过打孔器取得部分耳阔，获取2～4周龄的可能的转基因首建鼠的组织样品，用于提取DNA，通过PCR或者Southern杂交技术确定目的基因的整合情况。 

小鼠在6～8周龄性成熟时可以用于交配建系。出生的转基因后代也通过PCR或Southern杂交方法鉴定，留存含有转基因的动物，进一步繁殖扩大，以便实现①通过几代的繁育来观察转基因的表达和遗传性；②扩大群体数量为试验研究提供更多的小鼠；以及③产生纯合转 基因鼠并与杂合转基因鼠进行比较。 

疾病动物模型的建立是转基因研究的重要领域，其中癌症动物模型的建立尤为受到重视。这是因为，癌症是威胁当今人类生命的第二大疾病。据WHO报道，2005年全球有5800万人因病死亡，二其中有13％为罹患癌症死亡。世界各国不断投入大量的资金和人力用于癌症发生机理研究和治疗性药物的研制(Wynn，2007；Clin Invest.117：524-529；Galanski and Keppler，2007，Anticancer Agents Med Chem，7：55-73)。但是，无论是在基础研究领域还是在药物研发领域，都会遇到因缺乏合适的评价手段和研究平台而导致工作停滞不前的被动局面，为适应这一需求，各种通过现代生物技术手段对受体动物基因组进行改造的遗传修饰动物模型(Genetic Modified Animal model)应运而生(Barone Metal，2006，Mol Med，12：115-23；Choedon et al，2006，World JGastroenterol，12：2517-2522)。癌症转基因小鼠模型的出现有力的推动了癌症研究的发展，它是在分子水平和整体水平开展有关癌发生、发展、转移(Tanaka et al，2006，Ann N Y Acad Sci.2006，1086：1-10)和防治研究(Galanski and Keppler，2007，Anticancer Agents Med Chem，7：55-73)的良好活体材料，也是癌相关药物研制、新药安全性评价的优良平台(Mitsummori，2003，J Toxicol Sci.28：371-383)。从中获得的信息和数据、以及这些数据与人体的相关性是其它离体手段难以取代的。 

对于致癌性评价而言，传统的致癌性实验多采用大小鼠进行，时间长(需2年)、费用高、结果针对性差。鉴于此，ICH等国际机构倡用导新的手段来评价药物的致癌性，转基因癌症动物模型是理想替代手段。因此，建立优秀的癌症动物模型十分必要。