[发明专利]猪精囊腺生物反应器小鼠暂态表达检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及利用猪精囊腺生物反应器构件，在小鼠体内进行暂态表达，从而进行猪精囊腺生物反应器表达特性分析的方法。

背景技术

动物生物反应器是指将外源目的基因导入到动物基因组中，该外源基因可以传递给后代，并能够表达相应目标蛋白，所获得的个体表达系统就是动物生物反应器。目前转基因动物生物反应器已经成为重要的生产重组蛋白的方式。用于表达的生物反应器包括乳腺组织、动物血液、泌尿系统、输卵管组织、精囊腺组织等。动物生物反应器的归宿动物是家畜(禽)，如奶牛、绵羊、猪和鸡等。建立动物生物反应器的表达模型对制作转基因大动物具有重要意义，原因在于：其一，检测所构建的表达载体是否能有效表达；其二，表达水平如何；其三，表达的组织特异性如何。

目前表达模型主要包括细胞表达模型，转基因动物表达模型等。其中细胞模型需要培养相应的细胞，然后将表达构件转染细胞，检测构件的表达情况。然而细胞表达存在培养比较困难，无法进行组织表达特性分析等缺点。目前，转基因动物表达模型主要是转基因小鼠，已有的乳腺、血液、泌尿等表达系统都以转基因小鼠为表达模型。然而转基因小鼠制备仍存在费时费力，成功率低等缺点。在一定程度上限制了动物生物反应器的研究进展。

发明内容

本发明目的在于建立一种简单、非手术、经济、实用的猪精囊腺生物反应器小鼠体内暂态表达模型，表达载体经尾静脉注射后，经过血液循环至精囊腺等组织表达，从而方便进行猪精囊腺生物反应器转基因构件表达特性研究。

本发明技术方案包括猪精囊腺生物反应器表达载体构建、重组载体的注射方法、基因转染剂的选择、注射剂量、表达检测，具体包括以下步骤：

1、猪精浆蛋白基因调控区克隆：根据Genbank已发表的猪精浆蛋白II基因序列(AJ853849)，设计引物，以猪基因组为模板，扩增猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区，长度为4087bp和3094bp，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2、猪精囊腺生物反应器表达载体构建：将猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区亚克隆入改造过的pcDNA3.0载体，然后从商业化质粒pEGFP-N1中绿荧光蛋白基因表达盒切出，包含多聚腺苷酸化信号DNA，插入至猪精浆蛋白II基因5’和3’端侧翼区中间，构建成猪精囊腺生物反应器表达载体PSPII-EGFP。

3、暂态表达：将PSPII-EGFP重组质粒与基因转染剂PEI混合，将成年公鼠麻醉后，经尾静脉注射入体内；

4、表达检测：将小鼠杀死后取附性腺组织制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察报告基因表达，并提取各组织总RNA和总蛋白，进行RNA和蛋白水平表达检测。

在上述步骤1中，所说的引物具体是：

5’侧翼区上游引物为：

5’-AG TCGCGA TGA GTT GAG GGG TAT TCA CCA AAC-3’

5’侧翼区下游引物为：

5’-AT GGTACC ACGCGT CTC AGC AGC CTG GCC CTA GC-3’，

3’侧翼区上游引物为：

5’CT GGTACC TGC TGT AAT CAT TTT GAA TAA AG 3’，

3’侧翼区下游引物为：

5’AT CTCGAG GTG AAC TGT TTA CCA TGA ATT GT 3’。

在上述步骤2中，所说的对pcDNA3.0的改造，包括用限制酶Pvu II消化pcDNA3.0载体，切除其中的neo基因及其表达调控序列。

在上述步骤3中，优选将PSPII-EGFP重组质粒与基因转染剂PEI按1微克：2微升混合，PEI的使用浓度为10毫克/毫升；注射剂量为了2微克质粒每克体重。

本发明与现有的技术相比，具有快速、经济、实用等优点，而且可对转基因构件的表达水平、表达组织特异性进行检测。为猪精囊腺生物反应器的快速研制提供重要实验依据。

本发明中所使用的pcDNA3.0质粒来自Invitrogen公司，pEGFP-N1质粒来自BDBiosciences Clontech公司。

附图说明

图1为构建的猪精囊腺生物反应器表达载体PSPII-EGFP

具体实施方式：