[发明专利]以SecA动力泵为靶点的抗革兰氏阴性细菌药物筛选模型及用途

说明书

发明领域 

本发明涉及一种secA缺失的温度敏感型重组大肠杆菌，其高效表达革兰氏阴性细菌例如绿脓杆菌secA基因。本发明还涉及一种以SecA动力泵为靶点的新型抗革兰氏阴性细菌药物微生物细胞水平筛选模型，其利用高效表达绿脓杆菌secA基因的secA缺失的温度敏感型大肠杆菌，以及野生型大肠杆菌和绿脓杆菌，用于针对SecA动力泵靶点对候选微生物的次级代谢产物进行微生物细胞水平的抗革兰氏阴性细菌药物筛选。所述模型还可用于针对候选化合物的筛选。 

发明背景 

当前，革兰氏阴性细菌仍然是医院与社区感染中最重要的致病菌，而且耐药问题在革兰氏阴性细菌的感染治疗中也越来越成为一个难题。耐药革兰氏阴性细菌多为条件致病菌，占医院临床检出的耐药病原菌60％～81％[1、9、10]。常见的致病菌有：绿脓杆菌、大肠杆菌及肠杆菌属、阴沟杆菌、沙雷菌属、沙门菌属、枸椽酸菌属、肺炎杆菌、不动杆菌、流感杆菌等。耐药机制主要有：细菌细胞膜通透性改变；细菌主动外排系统；PBPs改变；产生β-内酰胺酶、钝化酶、酯酶、乙酰转移酶等灭活酶。而解决这一问题最为有效的方法就是寻找和发现新的作用机制的、与已有的抗生素无交叉耐药的新型抗革兰氏阴性细菌的药物。 

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属中的代表菌种。最早是在1882年从病人化脓的伤口中分离出来，但到目前为止，它仍然是一种重要的院内感染条件致病菌，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血症，肺炎，泌尿系统感染。近几 年的研究还表明绿脓杆菌与大多数囊性纤维化病人的发病率和死亡率有关[4]，在成年的病人中，81％的感染了绿脓杆菌[5]，绿脓杆菌中磷脂酶C的产生与病人肺功能的降低与病情的恶化相关[6]。由于绿脓杆菌外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动外排系统(ActiveEfflux Systems)，使得绿脓杆菌具有先天的多重耐药性，而当细菌与抗生素接触后，又可以产生抗生素的修饰酶；降低抗生素作用位点的敏感性而获得的后天的耐药性，导致经常表现对β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类、磺胺类等多种抗生素的多重高度耐药，临床治疗十分困难，一旦感染，死亡率很高，已经成为临床医生面临的治疗难题之一。因此，迫切需要发现新的抗绿脓杆菌等革兰氏阴性细菌的药物。 

从成千上万个微生物代谢产物中挑选所需的抗菌药物是非常艰难的一个过程。目前开发新型有用的微生物药物，虽然仍有很大的潜力，但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。因此，针对候选微生物的简单、快速、特异的筛选模型是关键。为摆脱筛选的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必须的组成成分或者临床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。 

为获得新抗革兰氏阴性细菌药物，本发明人引入了一个崭新的药物作用靶点，即：以SecA动力泵为靶点，通过本发明所述筛选模型，筛选新的抗绿脓杆菌或大肠杆菌以及其它耐药菌的新化合物。 

发明内容

众所周知，蛋白质的翻译是在细胞质中进行的，但是研究表明在革兰氏阴性细菌中，大约有三分之一的蛋白质必须穿过细胞内膜运送到周质或分泌到细胞外才能发挥它们正常的功能[7]。细菌中含有多种蛋白质转运的途径，但最主要的途径被称之为分泌途径(secretionpathway)，简称为Sec途径。大多数的分泌蛋白和一些整合膜蛋白的转运都是通过这条途径进行的[8]。分泌蛋白是以前体的形式合成的， 其氨基端都含有信号肽。它们通过共翻译或翻译后转运的形式穿过细胞内膜[9]。这一过程是由转运酶所催化的[10]。转运酶是由多个亚基组成的复合体，其中的核心部分包括SecY、SecE和SecG组成的膜整合区以及SecA二聚体组成的外周区[11]。而其它的组分包括SecD、SecF和YajC都不是蛋白质转运所必须的，但与蛋白质转运信道的稳定性和转运效率有关[12]。蛋白前体以非折叠的形式，通过ATP和PMF的能量输入形式进行跨膜转运，最终信号肽在周质中被信号肽酶水解除去。释放的成熟蛋白或在周质伴侣分子的作用下折叠成它正确的构象或继续被运送到细胞外或嵌合到细菌外膜中。