[发明专利]一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，特别是重组的人血清白蛋白及人血清白蛋白融合蛋白的纯化。本发明使用了特定的柱层析步骤，尤其是Capto-MMC填料应用于处于各种盐浓度(特别是高盐浓度)下的重组蛋白质纯化，并适用于试验室、中试规模及工业化大规模生产中的与人血清白蛋白相关重组蛋白质的有效分离和纯化工作。特别是经酵母菌或传代脊椎动物细胞分泌表达的重组人血清白蛋白和人血清白蛋白融合蛋白的规模化生产应用。本发明的纯化步骤简单、并具有独特性、普遍性和意想不到的效果。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人血液中最丰富的蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半，其作用为维持渗透压，结合并运输营养物和代谢物，HSA作为一种基本载体，携带传递蛋白质、脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要组成部分。血清白蛋白是一个球状非糖基化，分子量为66kd的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上有16961碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可以编码的一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)在通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，分泌到细胞外。人血清白蛋白有很大的应用及临床应用价值。例如：作为药物可用于治疗因血清白蛋白丢失、合成障碍和创伤失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症；可以作为细胞培养基的添加成分、可以作为药物的辅剂、赋型剂等等。现在人类获得人血白蛋白的方法是从人血液中分离纯化获得的。然而这一方法存在巨大的问题，例如：血源的短缺，不经济，以及受乙肝病毒、AIDS病毒、疯牛病等病原微生物的污染。为避免这些问题，基于重组DNA技术方法生产重组人血清白蛋白(rHSA)的多种方法获得研发。利用微生物体重组表达人血清白蛋白的大规模生产工艺和技术已在本发明人的中国授权专利ZL200410057313.7，以及专利申请EP330451和EP361991中公开。表明白蛋白的重组技术和纯化方法可行。但如何有效地从这些宿主生产细胞获得的发酵液、细胞培养液中提取rHSA仍是至关紧要的且随时有待提高的关键步骤。因为发酵液尤其是来自酵母菌的发酵液含高盐、高菌密度、高粘稠度、高色素含量、目标蛋白的蛋白降解物(这些降解物的蛋白序列与目标蛋白的序列相同而具有相似的特性，在分离纯化时更难于分开)等不利因素。

EP0612761公开了一种生产高纯度重组人血清白蛋白的方法，其中产品中不含自由的非抗原性杂质。这一方法在特定环境下运用了疏水层析色谱(HIC)及其它步骤如：离子交换色谱，硼酸或硼酸盐处理，超滤及加热处理。然而，这一方法因步骤多而变得太复杂，从而难于满足大规模工业生产的经济要求。

EP0570916也公开了用基因操作技术生产rHSA的方法，该方法包括超滤发酵液上清、加热处理、酸处理和再次超滤，随后使用阳离子交换、疏水层析和阴离子交换以及盐析等一系列步骤。然而，与上述专利存在相似的问题，纯化过程太复杂，因周期长成本高而不能成为大规模生产的有效办法。

EP0699687公开的rHSA纯化方法为：加热细胞培养液以灭活蛋白酶，再经阳离子交换微粒的流化床(Streamline)处理，洗脱液再经超滤、HIC和阴离子交换层析而得到纯rHSA。然而，流化床对设备的要求与常规装填的层析设备不同。特别是完全不适合用于毕氏酵母菌表达生产系统。因为在毕氏酵母菌发酵液中，菌体占40％以上，含糖量高、粘稠度大的发酵工艺。因而，需要有更经济有效的方法从发酵液中直接分离rHSA和它的融合蛋白。

于在林等为此在中国发明专利ZL021428816、ZL2004100428148和CN2007100575719中，公开了一种利用Blue-Gel(蓝色亲和柱层析)介质填料用于分离纯化人血清白蛋白及与其形成的融合蛋白的具有通用性的纯化方法。但蓝色凝胶与白蛋白有较强的结合度极高、不易回收目的蛋白、条件剧烈、得率低、不能使用高盐上柱，需要大体积稀释样品等不足。

中国专利申请CN031235026给出了一个十分有效的从毕氏酵母菌发酵液中获得重组人血清白蛋白的纯化方法。但其采用的、十分重要关键的一种可耐高盐的弱阳离子介质是专有的，不能从商业途经购买和试用。同时该公开的申请中也没有提及这种介质是否可用于人血清白蛋白融合蛋白的纯化工作。从分子的结构上看，本发明中发现和采用的这种层析介质填料与中国专利申请CN031235026所公开的介质填料具有明显不同的配基分子结构。