[发明专利]一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品活性检测技术领域，具体涉及血管内皮抑制素生物活性的检测方法。

背景技术

血管生成抑制剂种类很多，其中针对血管内皮细胞增殖的血管生成抑制剂是重要的一类，它们以血管抑素(angiostatin)、血管内皮抑制素(endostatin)等为代表。血管内皮抑制素是胶原XVIII羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物，具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的活性，是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子。

目前血管内皮抑制素(endostatin)主要是利用DNA重组工程技术制备重组血管内皮抑制素，以原核或真核表达系统，将血管内皮抑制素基因经克隆、表达和纯化得到具有细胞增殖抑制活性形式的重组蛋白质。

现有技术中检测endostatin的细胞增殖抑制活性的方法主要是根据endostatin可能的作用机制，采用endostatin抑制HUVEC、HDVEC、HMEC、ECV304等不同细胞增殖、迁移来检测其细胞增殖抑制活性，但所选择实验材料及检测结果差异非常大，其中很多检测结果重复性差。

另外，从中国生物制品检定所了解到，国内也有厂家采用endostatin抑制小鼠肿瘤生长来评价其生物学活性，但由于小鼠肿瘤大小差异非常大，因此体内测活方法缺少规律性，具有误差大、重复性差且操作难度较大等缺点。

以HMEC细胞迁移抑制法为例，重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)细胞增殖抑制活性检测存在以下缺点：(1)在实验中没有采用活性标准品进行误差的校正，另外实验中影响因素较多，造成实验误差较大，重复性差；(2)由于实验中采用在显微镜下人工计数染色的迁移细胞的方法，所以在选择计数的视野，以及细胞的判定上受人为影响因素较大；(3)实验结果的计算方法存在不科学的地方；(4)在规程附录中提供的方法存在描述不清，并且多处与实际操作不一致的缺点。由于存在上述缺陷，HMEC细胞迁移抑制法在评价endostatin的生物学活性时不够客观，具有误差大和重复性差的缺点。

鉴于上述方法存在上述缺点，endostatin的细胞增殖抑制活性难以被统一地进行客观评价，不能满足生产大规模、多批次产品质量控制的需要，所以客观上需要提供一种具有特异性强和重复性好的血管内皮抑制素活性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的检测血管内皮抑制素(endostatin)细胞增殖抑制活性的方法，该检测方法特异性强，重复性好，能客观评价血管内皮抑制素的血管生成抑制的生物学活性。

为实现上述发明目的，发明人经过反复大量试验，引进了血管内皮抑制素标准品用以校正不同批次血管内皮抑制素样品的检测误差，利用血管内皮抑制素对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的增殖抑制作用，用微量酶反应比色法反映活细胞数量，客观评价血管内皮抑制素的抑制或杀死HUVEC的效果，得到了一种特异性强、重复性好的检测血管内皮抑制素细胞增殖抑制活性的新方法。

为了实现发明目的，本发明的技术方案如下：

一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法，包括如下步骤：

a、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代培养至对数生长期，胰酶消化后均匀悬浮，向培养孔中接种相同体积的细胞悬液；

b、将血管内皮抑制素标准品和待测样品在步骤a所述的培养孔中分别进行相同浓度梯度的倍比稀释，培养孔中细胞悬液继续细胞培养；

c、微量酶反应比色法测定培养孔中的OD值；

d、将血管内皮抑制素标准品和待测样品的倍比稀释浓度分别与对应的OD值采用四参数origin拟合，分别得到血管内皮抑制素标准品和待测样品抑制型S-形曲线，所述四参数为最大光吸收值、最小光吸收值、半效量浓度和斜率；

e、按下式计算试验结果：

样品生物学活性(U/ml)＝Pr×Ds×Es/(Dr×Er)，其中，Pr为标准品生物学活性；Ds为样品稀释倍数；Dr为标准品稀释倍数；Es为样品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。

其中，所述培养具体为：在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

其中，步骤a中所述人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代培养至对数生长期，具体为：人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代至第2-6代，并培养至对数生长期。

其中，步骤b中所述培养孔中细胞悬液继续细胞培养，具体为培养孔中细胞悬液继续细胞培养3-5天。