[发明专利]鼠抗醋酸甲羟孕酮(MPA)的单克隆抗体

说明书

技术领域：

本发明属于兽药检测和免疫学分析技术领域，具体涉及一种鼠抗醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体及其分泌抗体的杂交瘤细胞株。

背景技术

醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate，MPA)是一种孕激素类妇科药物，黄体酮衍生物，化学名为6α-甲基-17α-羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮醋酸酯，分子式为C₂₄H₃₄O₄，又称甲羟孕酮、甲孕酮、安宫黄体酮，主要用于妇女绝经期综合征疾病等激素替代疗法。MPA和其他同化性激素药物一样具有安情助长作用，MPA对动物有增肥作用，多用在饲料中作为促生长剂和非发情期诱导发情、诱发超数排卵、同步发情等方面，以提高繁殖率和经济效益(高彦生等，2002)，例如牛、羊、猪、鸡、鱼等的饲料。但MPA可对人造成广泛副作用，体重增加、虚弱、疲乏和不可逆高血压、脱发以及不规则出血、闭经、精神抑郁、失眠、恶心、乳胀等不良反应，甚至导致不孕不育症，也有专家担心这种生长激素还可能具有导致细胞快速增殖的危险。由于MPA作为饲料添加剂在动物体内不断累积可导致动物性食品中该药的残留，从而严重威胁着人类健康。

自2002年欧盟发生的MPA污染事件后，MPA的兽药残留问题引起世界的广泛关注。欧盟(EU)已明令严禁使用MPA，规定在食源性动物产品中残留最高限量(MRL)为“不得检出”。但是仍存在非法使用的现象，并且在美国、澳大利亚等一些国家还未禁止MPA的使用，因此，加强动物饲料和食品中MPA检测非常重要。目前用于MPA检测的确证方法是气相色谱-质谱(GC/MS)法(庄无忌，2003)，但该法仪器昂贵，检测成本较高，检测周期较长，技术也比较复杂。MPA免疫学分析方法敏感、特异、快速已成为国内外研究热点，制备出特异性强、效价高的MPA抗体是进行MPA免疫学分析方法研究的首要条件。目前国外已有以多克隆抗体为基础的商品化MPA检测的酶免疫技术(EIA)试剂盒(如5131MPA1p[3]08.05)，国内有关于MPA人工抗原合成、多克隆抗体制备和ELISA检测的报道(郭金花，2006；孙武勇，2007；杨泽晓，2008)，但是还没有注册商品号的相关MPA检测试剂盒生产，也未见MPA单克隆抗体研究的报道。申请人只检索到一篇主题相关的专利文献，文献号02125370.6，发明名称为：一种检测醋酸甲羟孕酮含量的试剂盒及其检测方法。多克隆抗体常受到人工抗原合成批次、免疫剂量、试验动物、免疫时间、免疫血清储存时间等多种因素的影响，很难提供标准化的相关试剂，而单克隆抗体特异性强、均质性好，效价高、稳定廉价，有望解决多克隆抗体不易标准化等缺点。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于利用免疫学技术得到抗MPA的单克隆抗体。

本发明目的在于利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌MPA特异性抗体的杂交瘤细胞株M68F9，并提供进行饲料和食品中MPA残留量免疫学分析所需的单克隆抗体。该抗体为一株稳定的鼠源性杂交瘤细胞株所分泌的IgG1型免疫球蛋白，能够与MPA发生特异性免疫反应。

本发明的目的通过下述技术方案实现，即MPA单克隆抗体的制备方法：(1)分别采用碳二亚胺法、混合酸酐法将MPA偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)上制备免疫原(MPA-BSA)与包被原(MPA-OVA)；(2)通过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆亚克隆获得分泌MPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)通过ELISA方法对其抗体效价、特异性、敏感性、亚类及稳定性进行鉴定。

附图说明

图1图示的是人工抗原MPA-BSA与MPA-OVA的紫外扫描鉴定结果。

本发明的优点：

本发明所提供的杂交瘤细胞株M68F9分泌MPA特异性抗体的性能稳定，所分泌的单克隆抗体特异性强，亲和力良好，其间接竞争ELISA敏感度可达0.05-0.01ng/mL。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例