[发明专利]猪圆环病毒2型的快速检测技术

说明书

技术领域

本发明属于动物医学领域，涉及一种从血液或组织中检测病毒的方法，以及这种方法的用途。更确切讲，本发明涉及利用环介导等温扩增技术而研发的从血液中或组织中检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员，属于单股环状DNA病毒，它是已知的最小的动物病毒之一，该病毒无囊膜，具20面体，平均直径为17nm，不具备血凝活性，可抵抗pH等于3的酸性环境，能在猪源细胞和vero细胞中生长，但不产生细胞病变。根据PCV的致病性、核酸序列和抗原性，可将PCV分为两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1和PCV2在核苷酸水平约有80％的同源性。PCV1无致病性，PCV2则是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的一种主要病毒。Ellis等一些学者报道猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可产生典型的PMWS症状，因此有必要在猪群发生PMWS症状时检测PCV2，并与PCV1、PPV、PRV、PRRSV做进一步鉴别诊断。根据临床症状和病理变化可对PCV2进行初步诊断，病毒的确切诊断主要依靠实验室诊断技术。

PCV2的临床典型症状包括进行性消瘦，皮肤苍白，呼吸困难，厌食，精神沉郁，被冒蓬乱。解剖变化主要包括肠系膜及腹股沟淋巴结异常肿大，肺部灰褐色炎症病变，如有并发或继发感染，则其淋巴结可见出血、变性或化脓等病变肺脏病变也比较明显，如肺肿胀、变性、表面有许多大小不一的橡皮状硬块等。有的病例其肝脏表面有白色增生花纹，有的则呈现黄疸性肝炎。淋巴结的皮质有单核细胞或巨噬细胞浸润，有时还散布着大量多核巨噬细胞。有些病例出现淋巴细胞减少、淋巴结基质增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡中心部有蜂窝状坏死，其周围形成由组织细胞、类上皮细胞性巨细胞、多核巨细胞、淋巴细胞以及嗜酸性白细胞聚集的炎性肉芽肿。肺有轻度多灶性或高度弥漫性间质肺炎，由于肺泡上皮细胞肿大、增生、水肿以及细胞浸润常引起肺泡壁显著肥厚，致使肺泡内有单核细胞、嗜中性白细胞及嗜酸性白细胞渗出，部分肺在支气管和血管周围还发生淋巴细胞和组织细胞浸润，并偶尔伴有多核细胞出现。

PCV2的基因组由两个主要的开放阅读框(ORF)组成，其中ORF1又称为rep 基因，编码一个与病毒复制有关的35.7ku的蛋白；ORF2又称为cap基因，编码一个大小为27.8ku抗原衣壳蛋白。

PCV2的实验室诊断技术包括病毒的分离鉴定和针对PCV2抗原和抗体的检测技术。病毒分离主要是通过接种实验动物或敏感细胞进行分离，PCV2分离常用的实验动物一般为SPF猪，常用的细胞为猪肾细胞或vero细胞，采取病猪肺、肝、脾、淋巴结、扁桃体等组织，制成组织匀浆，用氯仿处理以除去有囊膜的病毒，并接种无病毒和支原体污染的猪肾细胞，同时利用氨基葡萄糖短时间处理感染细胞，以促进病毒的增殖.由于PCV2感染细胞不产生病变，因此，通常以PCR技术来确定病毒的存在，有时还可用免疫荧光技术检测病毒的生长情况，或借助电镜技术和超薄切片法来观察PCV2病毒粒子。现已证实，PCV2在PK15细胞上多代盲传才能有效增殖。针对病毒抗原的实验室诊断方法一般包括聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交、免疫组化技术等，其中原位杂交技术可检测出固定组织中的病毒抗原，免疫组化技术可用于病毒抗原在组织培养和机体细胞内生长定位的观察。PCR技术则以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，它也是在PCV2的病原检测和定型中最常用的技术。针对病毒抗体的检测技术主要包括间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(EL ISA)和抗原捕获EL ISA检测技术等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏和经济的用于检测猪血液或组织中PCV2的环介导等温扩增方法。

本发明是利用环介导等温扩增技术，从猪血液或组织中提取核酸，利用所设计的引物进行扩增反应，检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定猪是否感染猪圆环病毒2型的快速检测技术。

本发明以猪血液或组织核酸提取物为模板，所使用的四条特异性引物为：

本发明的实现方法如下：通过使用特异性引物，利用LAMP技术扩增PCV2基因组上的特定区域，通过检测特定产物的形成与否，从分子水平对血液或组织样品中的PCV2核酸进行筛查。