[发明专利]连续式高处理量筛选

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日：1998年12月11日；申请号：98812079.8(PCT/US98/26465)；发明名称：同上。

发明领域

本发明涉及应用了至少一种多孔基质的连续式高处理量筛选方法(Continuous format high throughput screening，CF-HTS)，该方法使得制药工业能够同时对大量生物学或生化活性分布广泛的化学实体进行筛选。此外，CF-HTS也可用于进行多步骤的检测实验。

发明背景

生物学和生物化学检测实验的设计是为了对各种各样系统的活性进行测试，其中包括从蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白结合到细胞功能。在“高处理量筛选方法”(HTS)中应用了这些检测实验测试大量化学实体以探索这些化学实体先前未知的生物学或生物化学功能

一步(homogenous)和多步(heterogeneous)检测实验

所有不同种类的生物学检测实验都可归成两个大类：一步检测实验和多步检测实验。在一步检测实验中，同时加入所有的试剂，并测量或解释结果而无需另外的操作。例如，在皮氏培养皿中培养的细胞可用化学物质处理。如果化学物质对细胞是毒性的可通过简单地观察变清澈的区域而判断毒性。另一个例子是可以使用表达蛋白的细胞，所有表达蛋白能改变该细胞的颜色。生长于含X-gal琼脂上的表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的细胞这个例子中，根据β-gal蛋白表达量的不同细胞会不同程度地变蓝。因此对于任何影响报告基因，如β-半乳糖苷酶基因表达的生物学过程，可设计一个一步检测实验。一步检测实验的另一例子是利用一种在酶的作用下改变颜色或荧光的底物。最后，如Amersham的邻近闪烁检测(Scintillation Proximity Assays，SPA)，这样的技术能直接测量放射性标记的配基与固定到含闪烁剂小珠上的蛋白或任何配基结合物质的结合。以上所有的例子都是一步检测实验的例子，因为它们除了在最后的探测、测量或读取信号之前加入试剂外不需要任何另外的步骤

另一方面，多步检测实验需要至少两个不能合并成一步的步骤，因为这些步骤不同程度上固有地不相容。例如，许多多步检测实验要求按一定的顺序加入试剂(例如一些试剂将影响前面的步骤，但对于完成后面的步骤又是必须的)。这种情况的常见例子包括需要加入信号显示试剂以间接地报告反应产物的存在或浓度的检测实验。在多步检测实验中另一常见的步骤是洗涤步骤。在检测实验前期步骤中通常需要加入过量检测试剂，但在随后的步骤中需要洗去以便随后进行的实验不会出现过高的背景信号。例如，在放射性配基结合实验中，首先将标记的配基与结合到固相表面上的蛋白温育，但这些配基中只有一小部分真正结合有限的蛋白位点。温育后，在能准确测量结合的放射性配基之前，必须将过量的未结合配基洗去。洗涤可通过多种供选的方法完成，包括过滤、重复洗涤/倒干、沉淀/分相和/或离心。

许多生物学和生物化学过程只能通过多步检测方法测量。进而，尽管存在通过调整其他生物学或生物化学过程使之适合一步法的途径，但使用多步法可使这些其他过程更有效地发挥作用，或可以使用更容易得到的试剂进行操作。给出的多种一步检测技术的方法和试剂盒如SPA(Amersham)，荧光极化(Jolley公司和其它公司)和时间分辨荧光技术(Packard公司和其它公司)中只有少数是可由商业途径获得。而且，使用这些方法总是需要更多的费用和时间。对于多数检测而言，多步法可以更好地建立，并且更易于快速显示结果。因此，多步法，如ELISA、过滤结合、RIA、荧光素酶细胞检测实验等等的应用仍然很广泛。下文将就这些方法中的一些做法更为详细地描述。

高处理量筛选(HTS)

多年以来，制药工业越来越依赖于筛选化合物库的HTS以发现候选药物。HTS是指一种平行测试许多离散化合物以便同时或几乎同时筛选大量测试化合物的生物学活性。目前，使用最广泛的方法采用了96孔微量滴定板。在这种方式中，在一块含96个反应孔的8cm×12cm的塑料板上同时进行96个独立的测试。这些孔要求的检测容量通常为50-500μl。对于许多一步和多步检测实验而言，除了板外，还可从商业途径获得多种与这种96孔板方法配套的仪器、材料、移液器、机器人、洗板机、和读板仪等等。