[发明专利]H5型和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于对禽类及其产品是否感染传染病进行检测的方法，确切讲是一种检测禽类及其产品是否感染H5型或H9型禽流感病毒或新城疫病毒的方法。

背景技术

禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)一直是影响养禽业的最主要病原。虽然通过疫苗的广泛使用，使得禽流感和新城疫的流行得以控制，但近年来，在我国流行的H5和H9型禽流感及新城疫在高免鸡群中呈现流非典型症状，常以产蛋量大幅度下降，低死亡率，呼吸道症状及后期的神经症状为特征，临床很难区别禽流感病毒的亚型和新城疫病毒。因此，对禽流感病毒和新城疫病毒的检验与诊断方面的研究具有重要意义。

流感和新城疫是呈全球分布的传染病，各个国家都有不同程度的发生。流感对人类的危害众所周知，它的发病率和造成的死亡人数至今仍列为传染病之首。新城疫也有感染人的报道。在畜牧兽医方面，它也威胁着多种家畜家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存，从而对经济也造成极大的影响。由于流感病毒和新城疫的毒株众多，毒力差别很大，所以临床症状也千差万别。尤其H5和H9型禽流感及新城疫很难与其他有类似症状的传染病区分，而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性症状和剖检变化，这给流感的诊断和防治带来极大的困难。因此，单靠临床诊断常常难以定性。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径。特别是随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展，流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。同时，分子生物学的发展为流感病毒核酸序列分析创造了条件。

为了确定流感和新城疫是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过病原学检查以确诊病原的存在。流感病毒和新城疫病原学检查，一般用生物学实验、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。这些技术方法虽然得到承认、采纳和应用，但是它们有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较底、有的检测周期太长、有的费用太大，而且这些方法大多都需动用活病毒，存在向周围环境散毒的隐患。一般基层单位要开展此项工作，存在不少困难，特别是被检材料污染，检出更为困难。因此进行新城疫病毒的分离鉴定，不仅需要严格的无菌取材，还需要低温保存，迅速送检，这往往也是一般工作现场难以办到的。因而建立一种快速诊断该病的方法，已成为流感和新城疫防治技术研究的重要课题。

发明内容

本发明提供一种快速、简便、灵敏和经济的检测的方法，且这种方法用于检测临床样品时，可区分出病禽所感染的是H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。

本发明的方法从待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者死禽的器官组织中提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以H5A、H9A和F为靶基因的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检禽是否感染有H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。

本发明中所用的引物分别是：

H5A为靶基因的引物为

上游引物：5′-ACGTATGACTATCCACAATACTCAG-3′

下游引物：5′-AGACCAGCTACCATGATTGC-3′；

H9A为靶基因的引物为：

上游引物：5′-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3′

下游引物：5′-TGGGCGTCTTGAATAGGGT-3′

F为靶基因的引物为：

上游引物：5′-TCAATCATAGTCAAGTTGC-3′

下游引物：5′-ACCCTTGTATCCTGCGGAT-3′

在本发明中无菌取待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者死禽的器官组织，用灭菌生理盐水研磨成1∶5稀释的乳悬液，全基因组RNA提取方法采用Trizol法。

本发明较经典的病毒分离、单个RT-PCR方法和血清学分型方法快捷。本发明可以比较方便地一次性鉴定出属于H5、H9型禽流感病毒和新城疫病毒中的那一种病毒感染，可以及时对禽染病情况及区域、环境作出及时快捷的反应，以在最短时间内作出正确的处置办法。这对及时扑灭或治疗禽类的传染病有着积极的意义。另外，本发明较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。本发明采取的提取全基因组的Trizol法快速、简捷、低成本，所需试剂种类少，特别适于小样品提取。因此，本发明具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明与标准样进行的特异性检测的电泳图，附图2为对临床样品评估的电泳图。