[发明专利]山羊S6K2基因cDNA编码区核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K2蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码S6K2蛋白质的cDNA编码区477bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。

背景技术

细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。尽管目前对细胞生长和细胞周期分裂是如何协调的机制理解的还很少，但信号蛋白TOR(target of rapamycin)在从酵母到果蝇直至哺乳动物细胞中作为细胞生长的中心协调器的作用已为人们所认识，这一在进化上保守的协调器调节着基本的生物加工过程。最具特色的mTOR下游效应器包括两条信号通路，即4E-BP1(真核细胞翻译启始因子4E(eIF4E)结合蛋白1)和S6Ks(核糖体蛋白S6激酶)，形成了两条平行的调节mRNA转译的信号通路。

哺乳动物细胞中有两种S6Ks蛋白，即S6K1和S6K2，它们分别由两个基因所编码。两种蛋白在组成、结构和功能等方面都是相近的。S6K2是一个属于AGC激酶家族的Ser/Thr激酶。S6K2蛋白包含了5个主要的结构域，自N端始分别为NT(N-terminal domain)，catalytic domain，the linker region，autoinhibitorydomain和CT(C-terminal domain)。S6K2有两种形态，分别称为S6K2β1(p70β1)和S6K2β2(p70β2)。人的S6K2β1含有495个氨基酸残基，S6K2β2含有482个氨基酸残基，二者仅在N端相差13个氨基酸并且在S6K2β1多出的13个氨基酸中包含了核定位信号。编码p70β和p70α的基因核苷酸序列的同源性为70％，而氨基酸序列同源性为85％，进一步的结构分析表明，在S6K2的C端也有核定位信号，故S6K2的两种形态都是核型的。实验证明S6K2在小鼠细胞生长和胚胎发育中起着重要的作用，S6K2影响着蛋白的合成和细胞的生长。

迄今，关于S6K2在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关山羊细胞中S6K2的研究报道，也未见有山羊S6K2基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊S6K2蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚山羊的S6K2基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组S6K2蛋白制备的抗体可以检测S6K2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

发明内容

本发明人已经努力从山羊的不同组织细胞中分离S6K2基因。作为结果，本发明人从山羊肌肉组织细胞分离了S6K2基因的cDNA编码区479bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它的前477bp推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛的S6K2基因(XM-582478)cDNA编码区的序列，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增山羊S6K2基因cDNA编码区片段的简并引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了山羊S6K2基因的cDNA编码区479bp片段，序列分析表明与牛的序列(XM-582478)同源性为98％(470/479)，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有3个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为“gS6K2”。

所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的S6K2的核苷酸序列设计简并引物，然后通过RT-PCR方法克隆山羊S6K2基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊S6K2蛋白的基因的cDNA的编码区477bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。

附图的简要说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中：

图1显示了牛S6K2基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号XM-582478)。

图2显示了477bp的山羊S6K2基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3是显示从山羊肌肉组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(479bp的cDNA gS6K2)的电泳图。