[发明专利]一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法

说明书

技术领域：

本发明属于一种测定生物细胞反应性方法，具体涉及一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法。

背景技术：

由于先天和后天因素，不同患者的细胞对药物的敏感性存在个体差异性，导致不同药物用于不同患者后，其患者反应性不同，包括对靶细胞的增值抑制作用，细胞毒作用，细胞因子分泌作用等，检测患者靶细胞对不同药物的敏感性，可以为患者筛选出有效的治疗药物，可以增加治疗疗效和减少副作用，防止无效治疗和对患者身体和经济的损失，实现个体化治疗。可是目前市场上尚没有专门用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法。

三、发明内容：

本发明就是针对不同患者对药物敏感性不同的特点，提供一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，解决盲目治疗疗效差、副作用大，对患者身体和经济易造成不必要的损失的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，由以下步骤组成：(1)外周血淋巴细胞制备，采取患者外周静脉血3～5毫升，抗凝，用磷酸盐缓冲液等体积稀释，将稀释后的血液加在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，2000转/分，离心20分钟，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，1500转/分，离心15分钟，弃上清液，再加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，计数后，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞用细胞培养液稀释成1×10⁶/毫升细胞悬液，备用，组织细胞制备：将新鲜手术组织用常规组织细胞分离方法，分离为单细胞悬液，用细胞培养液稀释成1×10⁶/毫升细胞悬液，备用；(2)含各种待测药物培养基制备：将各种待测药物用细胞培养液配制成2倍临床常规使用剂量峰值浓度的药液，备用；(3)细胞培养：将含各种待测药物培养液加入96孔培养板，每孔100微升，每个药加2孔，设空白对照孔，不含任何药物的细胞培养液，将制备好的患者细胞悬液加入上述培养孔中，每孔100微升，震荡混匀，置37℃，5％CO₂环境中保湿培养3-7天；(4)细胞标记：将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，每一种药物分别收集到一管中，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀中加入100μL磷酸盐缓冲液，混匀，再加入荧光标记的各种的单克隆抗体室温下，18～22℃，避光放置20～30分钟，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，加入0.3～0.5毫升磷酸盐缓冲液，混匀，待测。流式细胞仪测定：按照流式细胞仪常规操作，检测特定靶细胞的百分率，计算各种药物对靶细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因子采用细胞培养上清液检测，流式细胞仪测定分泌细胞因子含量，选择出对患者最有效的药物。其中，可检测的生物靶细胞包括：总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：不同患者细胞功能异常可能由不同的细胞，细胞亚群，亚亚群异常引起，通过本发明可以精确为细胞功能异常的患者选择出最有效的治疗药物，显著提高治疗疗效和减少无效治疗，减少患者身体的伤害和经济的损失，为国家和患者节约大量医疗成本。另外可以用于评估联合用药方案的效果，体外筛选新的药物，研究药物的作用机理，研究和制定新的治疗方案，研究新的药物等。同时，由于药物敏感性检测在治疗传染病，自身免疫性疾病，肿瘤等有较大的应用范围，所以临床应用可以产生显著的经济效益。

四、具体实施方式：

一种用于生物靶细胞药物敏感性检测的方法，由以下步骤组成：(1)外周血淋巴细胞制备，采取患者外周静脉血4毫升，抗凝，用磷酸盐缓冲液等体积稀释，将稀释后的血液加在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，2000转/分，离心20分钟，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入8mL磷酸盐缓冲液混匀，1500转/分，离心15分钟，弃上清液，再加入8mL磷酸盐缓冲液混匀，计数后，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞用细胞培养液稀释成1×10⁶/毫升细胞悬液，备用。组织细胞制备：将新鲜手术组织用常规组织细胞分离方法，分离为单细胞悬液，用细胞培养液稀释成1×10⁶/毫升细胞悬液，备用；(2)含各种待测药物培养基制备：将各种待测药物用细胞培养液配制成2倍临床常规使用剂量峰值浓度的药液，备用；(3)细胞培养：将含各种待测药物培养液加入96孔培养板，每孔100微升，每个药加2孔，设空白对照孔，不含任何药物的细胞培养液，将制备好的患者细胞悬液加入上述培养孔中，每孔100微升，震荡混匀，置37℃，5％CO₂环境中保湿培养5天；(4)细胞标记：将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，每一种药物分别收集到一管中，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀中加入100μL磷酸盐缓冲液，混匀，再加入荧光标记的各种的单克隆抗体室温下，20℃，避光放置25分钟，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，加入0.4毫升磷酸盐缓冲液，混匀，待测。流式细胞仪测定：按照流式细胞仪常规操作，检测特定靶细胞的百分率，计算各种药物对靶细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因子采用细胞培养上清液检测，流式细胞仪测定分泌细胞因子含量，选择出对患者最有效的药物。其中，可检测的生物靶细胞包括：总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，分泌IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。