[发明专利]针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体(以下简称McAb96-118)，属于单克隆抗体技术领域。

背景技术

A族链球菌(GAS)即化脓性链球菌，是一种常见的病原菌，它可以引起人类的多种感染性疾病，包括扁桃腺炎、咽炎、中耳炎等的浅表感染，及坏死性筋膜炎等具有高度侵袭及潜在致死性的感染，以及儿童猩红热等中毒性疾病，更为严重的是可导致感染后的超敏反应性疾病，如风湿热、急性肾小球肾炎等，临床上存在着反复感染及难以治愈等问题，因为目前尚无有效的疫苗予以预防，人类对其致病机制及疫苗的研究从未停止过。FbaA蛋白是一种表达于GAS表面的新发现蛋白，至少存在于18个血清型中。研究发现FbaA蛋白有抗吞噬及通过结合补体调节蛋白FH、FH-L以促进GAS进入上皮细胞的作用(参见Infect Immun.2003，71：7119-7128.)。本申请发明人的前期工作显示FbaA具有良好的免疫原性和免疫保护性(参见中国免疫学杂志，2007，23(9)：835-838，中华传染病学杂志，2008，26(3)：146-150)，有望成为疫苗的候选蛋白。

经国内外检索，尚未发现以A族链球菌表面蛋白FbaA为抗原制备单克隆抗体的相关文献。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为寻求新型GAS疫苗而开创新思路的针对A族链球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的单克隆抗体。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案：

本发明所述单克隆抗体是由以FbaA蛋白为免疫原免疫小鼠制备的杂交瘤细胞产生；

所述单克隆抗体的类型为IgG1；

所述第96-118位氨基酸的基因的碱基序列为：

acg tat aaa caa aaa att aaa act gca cca gac aaa gat aag ctatta ttc acg tat cat agt gag tat；

所述第96-118位氨基酸序列为：

TYKQKIKTAPDKDKLLFTYHSEY。

一、制备A族链球菌(GAS)表面蛋白FbaA的单克隆抗体(McAb)的方法

1.材料和方法

材料pMD18-T载体，高保真PCR系统，T4DNA连接酶及限制性内切酶均购自Takara生物公司。表达载体pGEX4T-2和E.coliBL21均为本室保存。FbaA⁺GAS标准菌株、FbaA^-GAS菌株及抗FbaA蛋白的兔血清均由Kansas大学Cue惠赠。小量质粒抽提及胶纯化回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。凝血酶购自PIERCE公司、6周龄的雌性BALB/c小鼠，购自河北医科大学实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为河北医科大学生物科技公司惠赠；RPMI1640粉末(用于培养细胞的培养基)购自GIBCO公司；HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液购自AMERECO公司；次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、氨基喋呤(A)等细胞培养添加剂购自SIGMA公司；聚乙二醇4000(PEG4000)购自MERK公司；弗氏佐剂购自SIGMA公司；碱性磷酸酶(AP)标记的抗小鼠IgG以及AP标记的抗小鼠IgG1-IgG4购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.以FbaA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠

2.1.制备融合FbaA蛋白

2.1.1.引物设计

根据网上公布的化脓性链球菌SSI-9(GAS M1血清型标准株)fbaA基因序列(编号：AB040536)设计引物，

P1：5′-TTAAGGATCCAGGAGGACAATATGCGTAGAGC-3′；

P2：5′-AGTGAATTCTCACCTGTTGAAGGCAAGTACTTACCTG-3′，分别在P1和P2上添加BamHI及EcoRI酶切位点(划线所示)。扩增的目的基因约为982bp，编码324个氨基酸，为FbaA蛋白第1位至324位的氨基酸片段。

2.1.2.PCR(聚合酶链反应)

以化脓性链球菌SSI-9为模板，用引物P1、P2进行扩增，94℃5min预变性；94℃30s，55℃30s，72℃40s，25个循环；最后72℃延伸7min。PCR片段经琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化。

2.1.3.融合表达质粒的构建