[发明专利]从牛初乳中分离乳腺上皮细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

本项发明涉及从牛初乳中分离乳腺上皮细胞的体外培养技术。

技术背景

乳腺细胞的培养，对于研究奶牛泌乳的生理、营养和内分泌调控，揭示影响奶产量和质量的遗传因素及其分子机制，探讨通过基因选择、内分泌和营养调控来提高奶产量具有重要的理论意义和应用前景。另外，利用体外培养的乳腺细胞系，通过转基因手段将高附加值的药用蛋白基因导入乳腺细胞，获得转基因乳腺细胞系，再通过转基因体细胞克隆技术，获得以奶牛乳腺作为生物反应器的专基因奶牛，是今后重组药用蛋白生产的一个具有广阔应用前景的领域。

目前，由于乳腺上皮细胞增殖分化过程受多种细胞因子和激素等复杂的时空调控，牛乳腺上皮细胞的培养、尤其是能够长时间稳定传代的原代乳腺细胞的分离培养仍然是具有很大难度和挑战性的一项技术，罕见成功的报道。

牛乳腺上皮细胞原代培养方法常规的有乳腺组织块种植法和乳腺组织胶原酶消化法，从牛初乳中分离培养乳腺细胞尚未见成功的报道。组织块种植法操作简便，细胞不易丢失，适用于小组织量培养。但是从种植的组织块长出细胞需要的时间较长，成纤维等结缔组织细胞最先长出，含上皮细胞丰富的细胞单层随后出现。胶原酶消化法，可获得更具组织代表性的细胞群，但工作量相对大，费用高(胶原酶价格高)。直接用这种消化物的滤过液培养，长出的往往是上皮和成纤维混杂的细胞单层，在酶消化过程中还存在丢失和损伤细胞的危险性。有文献报道，用胶原酶消化水牛、奶牛乳腺组织进行细胞培养，均未获得正常生长的乳腺细胞。故有人选择机械破碎法，这种方法操作较简便，比酶消化法快，但可对细胞产生机械损伤。此外，上述三种方法还由于组织取材不太容易，有一定局限性。为了解决这些问题，我们实验室采用从牛初乳中分离培养乳腺上皮细胞，获得了较好的效果。该方法样品材料来源广泛，取材方便，操作简单，避免了酶消化破碎法对细胞造成的伤害。从乳汁中分离得到的乳腺细胞纯度高，杂细胞少，体外培养细胞生长旺盛，形态规整，可用于各种体外研究。

发明内容

方法：

1、制备培养液RPMI-1640、用前添加FBS 20％、胰岛素1ug/ml、醋酸钠5mM、转铁蛋白10ug/ml、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml；

2、包被培养瓶用胶原蛋白包被培养瓶。取少量的胶原蛋白加入培养瓶，用自制的弯头玻璃管，将其推开，使之均匀的铺满底壁，以倾斜瓶时不流动为益，将培养瓶盖拧松，放置于超净工作台内5-6小时，用于接种细胞。

3、细胞来源  细胞来自泌乳一周内的荷斯坦奶牛乳汁中。用新洁尔灭水清洗乳房，再用75％酒精擦抹消毒乳头，用干燥、灭菌的容器采集50-100ml乳汁，以1000-1500rpm离心20min，仔细去除上清，用含青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml的D-hanks液清洗沉淀的细胞团块3-4次直到上清液不浑浊为止。

4、细胞原代培养及传代将离心所得细胞混悬在含20％FBS、1ug/ml胰岛素、5mM醋酸钠、10ug/ml转铁蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，接种于培养瓶内，置CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂饱和湿度下培养，3天后每天观察1次，从第5天开始每3天更换一次培养液，当细胞汇合度达到80-90％时，用Trypsin/EDTA消化，收集细胞，用培养液稀释制成细胞悬液态观察初培接入培养瓶中继代培养。

5、细胞形养细胞为圆形，经2-3天，细胞开始伸伪足生长。此时细胞呈短梭形、三角形或不规则多角形，第5-6天可见克隆形成。细胞逐渐向周围扩展铺开，成片生长。此时可观察到两种形态的上皮细胞，一种为多角形，细胞间联系紧密，呈大理石状；一种为短梭形，细胞互相衔接，呈鹅卵石状。随着细胞进一步汇合，培养瓶中形成以上皮细胞为主的不规则生长区域。第9-10天细胞基本连接成片，达底面积的80％-90％，有些上皮细胞区域的边缘出现细胞堆积现象。继代培养后，乳腺上皮细胞出现水泡样或圆形中空的腺腔样结构。