[发明专利]一种灵芝杂交育种方法

说明书

技术领域 本发明涉及一种食用菌育种方法，特别是一种灵芝杂交育种方法。 

背景技术 食用菌的育种方法一般包括野生种驯化、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种和杂交育种等。 

野生种驯化是从野生灵芝子实体中分离获得菌丝体，经过栽培试验，筛选获得优良菌种，这种育种方法需要分离获得大量的菌株，从中选出高产优质的品种，只能从现有的菌株中筛选，不能创造出新的种性。 

诱变育种是通过物理或化学的手段，促进变异，再从众多的变异体中筛选出好的品种，这是一种随机性很强育种方法，需要大量的筛选才有可能获得好品种。 

原生质体融合育种是一种用于远缘杂交克服“种间性隔离”的技术，上世纪八十年代在食用菌广泛研究，但由于在有丝分裂过程中有些染色体会丢失，融合子不稳定，这种育种技术未得到广泛应用。 

基因工程育种是近年来发展起来的新技术，具有目标明确的特点，但这一技术在食用菌育种中还处在研究试验阶段，尚未广泛应用。 

杂交育种，国外有用酵母菌与灵芝孢子共培养，培养时间4—6周，可诱导少量灵芝孢子萌发，萌发率低于1/10⁸。国外的这种方法存在以下缺点：①试验时间长；②萌发率很低，需要大量的试验才能获得可用于杂交的单孢菌株；③需要除去酵母菌后才能用于杂交。由于酵母菌的生长速度远远快于灵芝菌丝，如果没有除去酵母菌，经常会由于酵母菌大量生长而使灵芝菌丝不生长。 

杂交育种是一种有效的品种改良技术，杂交育种可以组合双亲的优良性状、表现出杂种优势，培育出超越亲本的杂交种。杂交育种在食用菌中已广泛应用，取得很大成效。 

现代医学研究证明，灵芝对治疗神经衰弱、慢性支气管炎、冠心病、心绞痛及高血脂、高血压、肝炎、造血系统疾病等有良好的疗效。由于含 有灵芝多糖，灵芝可以提高机体免疫功能，增强体质，具有抗肿瘤的作用。 

我国灵芝年产量约2000吨，创产值约20亿元人民币，在50多种食用菌中单种产值最大。但由于我国灵芝人工育种研究相对落后，我国主栽的品种都是从国外引进或者是从引进品种分离获得。这种状况在一定程度上制约灵芝产业的发展。 

鉴于灵芝具有很高的药用价值，灵芝产业又是一个很大的产业，如果能建立一种高效的杂交育种技术，将会促进灵芝新品种的培育，进而促进灵芝产业的进一步发展。 

发明内容 本发明目的是探索解决灵芝杂交育种中单孢菌株难以获得的问题，为灵芝的杂交育种提供一种新方法。 

本发明的一种灵芝杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选，其特征在于 

1、所述菌丝裂解 

将经过2次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于30℃的循环水浴锅中恒温水浴至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；所述稳渗液为0.6M甘露醇水溶液；所述溶壁酶液为含2％溶壁酶的稳渗液。 

2、所述单细胞再生， 

离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野，将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于25℃培养箱中培养，至单细胞开始萌发； 

3、所述单核细胞分离 

从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基放入斜面培养基中，于25℃培养，长出3～5cm的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株，即为单核菌株。 

本发明的灵芝杂交育种方法，解决了由于灵芝孢子的细胞壁很厚，在人工条件下几乎不萌发，难以进行杂交育种的难题。 

本发明的灵芝杂交育种方法，通过菌丝裂解形成单细胞，并萌发成单核菌株进行杂交育种，整个过程不超过20天即可完成，单核细胞的获得率不低于35％，杂交育种的速度快、成功率高。 

利用本发明的方法进行灵芝杂交育种，其后代的遗传性状稳定，而无论是诱变育种还是原生质体融合育种所得到的后代，通常遗传性状不稳定。 

由于常规的杂交育种需要担孢子作为原材料，而担孢子是从灵芝子实体中弹射而来，因此常规的杂交育种受季节限制，一年只能做一批；本发明的杂交育种方法，所用的原材料是灵芝的菌丝，通过液体发酵，几天时间就可以得到，不受季节限制，一个月就可以做几批次。 

具体实施例：为了充分公开本发明的灵芝杂交育种方法，以下结合实施例加以说明。