[发明专利]鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠神经生长因子的制备方法和注射用鼠神经生长因子的制备方法，尤 其涉及一种使用新型的病毒灭活法制备鼠神经生长因子的方法。

背景技术

鼠神经生长因子(NGF)是从小鼠颌下腺中分离纯化的神经生长因子的冻干制品，其 传统制备工艺为：将小鼠颌下腺组织匀浆，得匀浆上清液；然后将匀浆上清液离心、去沉 淀后，上离子交换层析I，收集流穿液；流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；酸 解上清液上离子交换层析，收集目标蛋白峰，即得神经生长因子原液；再加入赋形剂甘露 醇和稳定剂人血白蛋白，经除菌过滤后，分装，冻干得制品。

由于鼠神经生长因子来源于小鼠，因而该制品存在生物安全性问题，主要是鼠源性病 毒对原材料颌下腺的污染或潜在性污染。为了保证该制品的安全性，在控制供体鼠饲养环 境和原材料颌下腺质量的同时，研究生产过程中去除或灭活病毒工艺对制品的安全性起着 十分重要的作用。

对于血液制品来说，国内外较成熟的病毒灭活/去除工艺方法有巴氏消毒法、干热法、 有机溶剂/去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品尤其是 规模化生产量的鼠神经生长因子的病毒灭活工艺，国内外报道很少。

有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失 去传染性，从而达到灭活病毒的目的。但该方法对非脂包膜病毒没有去除作用，并且人为 引入了有机溶剂和去污剂，而彻底清除有机溶剂和去污剂有很大难度，因而加大了产品污 染的风险；纳米膜过滤法主要利用病毒颗粒和蛋白分子的大小差异通过纳米级的滤膜把病 毒除去，适用于分子量较小(直径较小)的蛋白，不适于较大直径蛋白制品的病毒去除， 且纳米膜价格昂贵；光化学法是利用某些光敏剂对病毒表面及病毒核酸结构有强烈的亲和 性，在适当波长的光照下易激活，从而通过光化学作用破坏与其接触的病毒结构，但是光 化学法对神经生长因子蛋白的活性损伤较大；巴氏消毒法属热力处理灭活病毒方法，即通 过热量使病毒蛋白变性，破坏病毒结构进而灭活病毒，对脂质膜病毒及非脂质膜病毒均能 有效去除，临床记录显示：巴氏消毒法是目前病毒灭活方法中最可靠的方法。但热力也常 使蛋白制品变性或生物学活性降低。如何能既保持神经生长因子活性，又能彻底地去除病 毒，这是目前尚待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠神经生长因子的制备方法，以解决现有技术中的上述问 题。本发明中的鼠神经生长因子的制备方法在传统工艺中加入100KD和5KD超滤膜过滤和 巴氏消毒工艺，可有效过滤大分子病毒，同时通过巴氏消毒法进一步灭活伪狂犬病毒 (PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，既不引入任何外来有机溶剂 和去污剂等污染物，又能保持鼠神经生长因子注射液的高纯度、高比活及高安全性。

本发明还有一个目的是提供一种注射用鼠神经生长因子的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种鼠神经生长因子的制备方法，将小鼠颌下腺组织匀浆，反复冻融破碎细胞，离心 去沉淀，得匀浆上清液；匀浆上清液去除细胞碎片后上阳离子交换层析I，收集流穿液， 流穿液进行酸化解离、离心，得酸解上清液；将酸解上清液上阳离子交换层析II，收集 目标蛋白峰，得蛋白收集液，其特征在于：将蛋白收集液进行超滤结合巴氏消毒法去除病 毒，再经超滤浓缩，除菌过滤后制得。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，将蛋白收集液进行100KD超滤膜过滤后，将100KD 超滤膜滤下液用注射用水或注射用生理盐水稀释至1～40μg/ml，在55～65℃水浴中恒温 1～12小时，然后经5KD超滤膜和除菌过滤制得神经生长因子原液。

100KD超滤膜过滤可去除液体中的大分子病毒；在55～65℃水浴中恒温1～12小时， 可有效灭活伪狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、脑心肌炎(EMC)病毒等潜在病毒，并保 持所制得的鼠神经生长因子的生物学活性；5KD超滤膜过滤可在浓缩样品的同时转换缓冲 液。

前述鼠神经生长因子的制备方法中，所述100KD超滤膜滤下液优选用注射用水或注射 用生理盐水稀释至5～30μg/ml，特别优选用注射用生理盐水稀释至20μg/ml。