[发明专利]斑茅抗旱cDNA表达谱芯片及其应用

说明书

技术领域  本发明涉及一种基因芯片及其应用，特别是一种斑茅抗旱cDNA表达谱芯片及其应用。

背景技术  我国人均水资源占有量仅2300立方米，只有相当于世界人均占有量的四分之一，每公顷耕地水资源占有量约为世界公顷均占有量的五分之四。干旱成为制约我国农业生产的关键因素之一，严重影响我国农业的国际竞争力和粮食安全。根据发达国家的生产实践证明，选育抗旱性强、水分利用率高的作物或品种是提高农业水分效率的最有效措施之一。克隆分离抗旱功能基因并遗传转化优异农作物品种以提高抗旱性具有重要的意义。

植物对干旱等逆境的适应是一复杂的生理生化过程，涉及众多基因的表达和代谢途径的启动，如信号因子、防御相关蛋白、渗透调节物质、DNA结构及转录调节蛋白等。植物抗旱cDNA表达谱芯片是一种高通量、高效率研究植物抗旱机制和筛选抗旱基因的重要载体。

抑制消减杂交技术是由Diatchenko等于1996年以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制PCR，并结合标准化(normalization或equalization)和消减杂交(substractive hybridization)。抑制PCR通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)充当引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列，PCR中不能扩增，从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA的丰度，即低丰度差异表达的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群(tester)与驱赶基因群(driver)间的同源序列(Diatchenko L et al.Proc Natl Acid Sci 1996；93：6025)。通过消减杂交过程使不同丰度的cDNA拷贝数趋于平衡，保证了低丰度cDNA得到有效富集，而杂交后采用的两次巢式PCR可有效降低假阳性，因而在分离差异表达基因的相关研究中得到广泛应用。在消减文库构建后，如何进行大量候选基因的鉴定与表达分析是后续实验中关键的技术问题。cDNA芯片技术采用的是mRNA反转录标记探针，因而相当程度上反映了mRNA原来的真实丰度，具有高通量和高效率的优点。Yang GP等(1999)的研究表明，SSH克隆经cDNA微阵列鉴定与经Northern鉴定的结果符合率高达90％，将SSH文库和cDNA表达谱芯片技术相结合，是差异表达基因分离、鉴定的理想策略。

目前基因克隆的常用技术为同源PCR克隆和图位克隆。由于生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，因此同源克隆是在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列为探针筛选目的克隆；或者根据已知基因的序列设计并合成一对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩增，扩增的片段纯化后连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列进行比较，如目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因(Masumura T et al，1989.Plant Mol Biol，12：123～130)。而图位克隆是根据遗传连锁分析，染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因，研究该基因的功能或抗性的生化机制，这样一种策略叫图位克隆(Monaco A P，1994.Currentopin Genet Dev，4：360～365)。

同源克隆技术是在近缘物种已分离同源基因的基础上，通过设计引物进行PCR扩增，进而结合cDNA末端快速扩增技术分离基因，无法一次获得大量系列基因片段，也无法分离植物新基因；图位克隆技术需要有植物遗传群体，并要求有较完整的分子标记技术体系，一次只能分离一个基因。

刘文荣等(2007)在《作物学报》2007.33(6)上发表了“干旱胁迫下斑茅消减文库的构建及分析”的文章，介绍了干旱胁迫下斑茅消减文库的构建方法。

中国实用新型专利ZL01214517.3公开了一种用于转基因产品鉴定的基因检测芯片，在平面型支承载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以微点阵方式排布有供转基因植物判断用的外源基因探针。

专利号为01104063.7的发明专利“聚合酶链式反应基因芯片制作方法”，介绍了一种基因芯片的制作方法，在体积很小的芯片内一次可进行大量的聚合酶链式反应(PCR)。