[发明专利]靶向肿瘤的模拟逆转录病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种靶向肿瘤的模拟逆转录病毒(mimoretrovirus)及其制备方法和应用。

背景技术

现代医学对于肿瘤仍缺乏有效的防治措施。大多数肿瘤的发生与基因变异密切相关，主要表现在癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突变、失活等方面，因此，抑制肿瘤相关基因的表达是研究与开发新型抗癌疗法的一个重要思路。RNA干预(RNA interference，RNAi)技术作为一种基因沉默的新工具，通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)特异性结合同源mRNA并促使其降解，能够快速、高效、特异地抑制靶基因的表达，将其应用到肿瘤基因治疗领域有着非常光明的前景。

目前，肿瘤基因治疗的首要问题是要能将治疗基因高效率地运送到肿瘤细胞中，同时尽可能不进入或较少进入正常细胞，因此，建立有效的靶向性导入系统成为当今肿瘤基因治疗的研究热点。由于siRNA合成费用昂贵、体内易降解、作用时间短、实际操作困难等问题，直接注射siRNA不适于肿瘤防治的长期过程，而多以基因载体协助siRNA进入细胞。基因载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒等，可以高效率地转染细胞，但其存在如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过程复杂，自身容量有限，制得的病毒滴度较低等缺陷。非病毒载体包括阳离子脂质体、壳多糖、胶原蛋白、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等，其与病毒载体相比虽然转染效率有限，但具有无传染性、不限制载体容量、化学结构可控制和可大量制备等优点，已日益受到研究者的青睐。但是，上述基因载体均存在无肿瘤细胞靶向性的缺陷。

发明内容

有鉴于此，为克服针对肿瘤相关基因的siRNA在体内靶向递送方面存在的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，以多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合多肽为基因载体，包裹肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体，自组装而成。

进一步，所述多聚赖氨酸为18个L-赖氨酸连接成的多聚体直链；

进一步，所述RGD肽具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

进一步，所述融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽通过柔性接头连接而成，所述柔性接头为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段；

进一步，所述融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽直接连接而成；

进一步，所述肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体为Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体。

进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列I，如SEQ ID No.3所示；

进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列II，如SEQ ID No.4所示；

进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列III，如SEQ ID No.5所示；

进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列IV，如SEQ ID No.6所示。

本发明的目的之二在于提供一种制备所述靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的方法，包括以下步骤：

a.用化学合成法制备融合多肽；

b.用常规方法制备siRNA逆转录病毒重组表达载体；

c.模拟逆转录病毒的制备：在浓度为140-160mmol/L的NaCl条件下，加入步骤2所得siRNA逆转录病毒重组表达载体，于搅拌条件下，缓慢加入步骤1所得融合多肽，加完后继续搅拌30-40分钟，再静置30-60分钟，融合多肽可包裹siRNA逆转录病毒重组表达载体，自组装形成电荷比为2-4的颗粒，即得模拟逆转录病毒。

本发明的目的之三在于提供所述靶向肿瘤的模拟逆转录病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果在于：