[发明专利]一种番茄红素的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种生物合成番茄红素的方法。

背景技术

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，分子式为C₄₀H₅₆，分子量为536.85。最近的研究表明，番茄红素的抗氧化性能是天然类胡萝卜素中最强的，它独特的生理功能越来越引起人们的重视：能高效猝灭单线态氧及清除过氧化自由基；通过影响人体细胞的活性以及营养物质的吸收及循环，控制细胞的生长及其代谢；作为一种低胆甾醇剂抑制胆固醇生物合成酶，调节胆固醇代谢，防治心血管疾病。因而番茄红素在食品、化妆品以及医药领域有重要的应用。

目前番茄红素可通过化学合成、天然提取和微生物发酵3种方法来获得。将上述三种生产方法作一比较：天然提取法由于番茄的种植为季节性产物，产量和含量受多因素控制，且番茄红素在番茄中含量不稳定，提取工艺繁琐冗长，成本昂贵；而化学合成法尽管成本较低，但由于污染环境及产品活性较低，产品应用范围受到限制；采用微生物发酵法生产番茄红素，其产品质量和生理活性完全和天然提取产品相同，且采用发酵法能降低成本，污染相对较小。因此，我们可以看出微生物发酵法是最具有潜力的生产方法。

虽然番茄红素在很多植物和微生物中均有分布，但由于其中所含色素的成分复杂致使提取单一组分的成本较高。随着不同生物类胡萝卜素合成基因的相继克隆，为利用微生物发酵来获取番茄红素提供了可能。crtI基因编码八氢番茄红素脱氢酶，在不同的物种中这种脱氢酶的作用有所不同。研究表明，Erwiniaherbicola是一种革兰氏阴性菌，不属于光合细菌，其crt基因族按照以下顺序来产生类胡萝卜素，首先八氢番茄红素经过4次脱氢形成番茄红素，然后依次产生β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质。而光合细菌Rhodobactersphaeroides的八氢番茄红素在同样由crtI基因编码的八氢番茄红素脱氢酶作用下只经过三次脱氢形成链孢红素，而后则生成羟化链孢红素、去甲基球状烯、球形烯及球状菌素，并不形成番茄红素。R.sphaeroides的突变株TC72是在原始菌株R.sphaeroides的crtI基因中插入转座子Tn5而得。研究表明，突变株TC72内虽然crt基因族是完整的，但由于Tn5的插入而使其类胡萝卜素合成途径停留在八氢番茄红素，crtI及以后基因的表达均被中断(如图1所示)。如果能够利用基因工程的方法使E.herbicola的crtI基因在光合细菌突变株TC72中表达，使TC72中积累的八氢番茄红素生物合成番茄红素。同时，由于TC72中不存在crtY和crtZ蛋白，使生物合成的番茄红素不被继续代谢成其他类胡萝卜素，从而使得光合细菌突变株TC72中利用E.herbicola的crtI蛋白生物合成的番茄红素在细胞内大量积累并容易分离纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄红素的制备方法。本发明方法将E.herbicola的crtI基因克隆并连接到含强启动子Puc的表达载体pRKR5上，结合转移到突变株TC72中构建工程菌，启动子Puc在厌氧条件下高效表达，通过氧浓度的调控使工程菌生产目的产物番茄红素。为实现工业化生产番茄红素奠定了基础，在生产实践中具有潜在的应用价值，有生产成本低，利于环保的优点。

本发明方法包括以下步骤：

(1)提取E.herbicola基因组DNA，通过PCR方法克隆出crtI基因全长；

(2)SacI-XbaI酶切pMD18-crtI质粒，将切下的crtI片段连接到含强启动子Puc的表达载体pRKR5上，构建表达载体pRKR5-crtI；

(3)通过接合转移的方式将表达载体pRKR5-crtI导入光合细菌Rhodobacter sphaeroides突变株TC72中；

(4)启动子Puc在厌氧条件下高效表达，调控氧浓度可诱导工程菌TC72-pRKR5-crtI累积红色色素。

经HPLC和吸收光谱分析，工程菌TC72-pRKR5-crtI中合成的色素为番茄红素，工程菌的生物量(干重)为2.36gDCW/L，番茄红素含量可达1.52mg/gDCW。