[发明专利]异源表达和纯化人类葡萄糖转运蛋白家族成员GLUT1、GLUT2、GLUT3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达和纯化蛋白的方法，尤其涉及一种异源表达和纯化人细胞膜上葡萄糖转运蛋白家族成员GLUT1、GLUT2、GLUT3(facilitated glucosetransporter，GLUTs)的方法。

背景技术

位于人类细胞膜上的葡葡糖转运载体(facilitated glucose transporter，GLUTs)是体内一类重要的膜蛋白，它们促进体内葡葡糖的跨膜转运，对稳定细胞能量和维持生命活动起到至关重要作用。到目前为止已相继发现并鉴定了多种GLUTs，它们分别由不同基因编码，具有相似的蛋白质结构和生物功能，在基因表达和细胞内分布受多种因素调控。人类GLUTs由429-524个氨基酸组成，不同GLUT有39％-65％的氨基酸组成相同，相似性为50％-76％。GLUTs除转运葡萄糖外，还可转运去氢抗坏血酸、D-甘露醇、D-半乳糖和D-果糖等。

GLUT1、GLUT 2、GLUT 3结构相似，都具有12个螺旋跨膜区(M1～M12)；其氨基和羧基末端均位于细胞质一侧；在载体蛋白的胞外侧都存在1个蛋白质糖基化位点，其中GLUT1、2在胞外M1与M2间的外环上存在QLS模体，而GLUT3分子的第7跨膜螺旋内存在QLS模体，该模体与底物特异性结合有关。

GLUT1分布最广，高效表达于人类红细胞、脑、眼、周围神经及胎盘等组织中。GLUT3则主要分布于神经组织，以脑组织中分布最多。GLUT1、GLUT3的主要作用是参与基础或组成性的葡萄糖转运，优先保证仅以葡萄糖为能量来源的组织器官正常功能活动。相同组织中GLUT1、GLUT3分布不同，其作用也有区别。例如脑中GLUT1主要分布于血-脑屏障的毛细血管内皮细胞，其功能是将血液循环中的葡萄糖转运进入组织；GLUT3则高效表达于神经元并集中于神经元突起，其功能是为树突和轴突的递质传导提供能量。

GLUT2是在β细胞和一些葡萄糖浓度高的组织(如肠、肝脏、肾脏)中表达的葡萄糖转运蛋白。GLUT2有很高的转运能力，对葡萄糖的转运特点和它所处的周围葡萄糖的浓度相适应，伴随血糖浓度升高对葡萄糖转运能力也随之升高。GLUT2在肝脏调节肝细胞葡萄糖的双向转运，在小肠和肾主要分布于可吸收上皮细胞的基底膜或嗜碱性侧膜，将上皮细胞内葡萄糖通过基底膜转运进入血液循环，参与葡萄糖的吸收和再吸收。

不同的易化葡萄糖载体对葡萄糖具有不同的亲和力和Km值，GLUT3对葡萄糖的亲和力最高(具有两个QLS模体，分别位于第277～279和281～283)，Km值为1～2mmol/L，这样有利于在血糖浓度较低时，将葡萄糖转运通过血脑屏障；而GLUT2对葡萄糖的亲和力最低(无QLS模体)，Km值为11～16mmol/L，这样又有利于肝脏、胰β细胞等在血糖浓度较高时对葡萄糖的应答反应和葡萄糖的跨膜转运；GLUT1对葡萄糖的亲和力介于GLUT3和GLUT2之间，Km值在2～5mmol/L。

GLUTs功能状态是细胞摄取葡萄糖，调节糖代谢的关键，与许多代谢性疾病(如糖尿病等)关系密切。因此对GLUTs在结构和功能、活性调节及其抑制剂、GLUTs作为药物靶标，抗体生产等方面的研究在帮助我们进一步了解疾病的发病机制及探索新的治疗途径上都有重要的作用，而这些，都需要GLUTs在体外的高效表达。

但和绝大部分膜蛋白一样，GLUTs的结构特性决定了其在表达，分离，纯化上存在诸多困难。主要原因在于：(1)天然膜蛋白含量低，绝大多数低于微克数量级；(2)膜蛋白难于体外表达，迄今未见膜蛋白高效表达体系的报道；(3)膜蛋白不稳定，分离、纯化比较困难。因此，目前制约膜蛋白结构生物学及功能研究、药物开发及膜蛋白抗体生产的主要因素是膜蛋白的高效表达及分离。所以，建立一套全新的可以稳定、重复、高效表达和纯化各种膜蛋白的体系，表达和纯化毫克数量级以上的膜蛋白具有非常重要的意义。

基于膜蛋白GLUTs的重要性，为了获得毫克数量级以上GLUTs，研究其高效表达和纯化的关键技术是该领域的技术发展趋势。建立一套全新的、稳定的、重复性好的高效表达和纯化膜蛋白GLUTs的体系，表达和纯化毫克数量级以上的GLUTs具有非常重要的意义。

发明内容