[发明专利]斑蝥素人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于小分子有机物人工制备抗原的方法，具体的说，涉及一种斑蝥素人工抗原的制备方法。

背景技术

斑蝥素(canthariding)是部分鞘翅目芫菁科昆虫(俗称斑蝥)合成分泌的一种小分子有毒物质，其化学结构为萜类化合物(C₁₀H₁₂O₄)。传统中医药及现代的临床应用研究发现，斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面具有独特的疗效。斑蝥素及其衍生物等对肿瘤细胞中的“斑蝥素结合蛋白”-蛋白磷酸酶2A有着极强的亲和性和专化性，对治疗原发性肝癌疗效显著(郑英兰等，2005；李琦等，2006)，也被用于治疗或辅助治疗乳腺癌、食道癌、肺癌、贲门癌、肠癌、肝硬化、慢性肝炎和神经性皮炎等疾病，同时可用于治疗疥癣、消瘰病等，是日前应用较多的理想的广谱抗癌药和皮肤外用药。此外，斑蝥素还能刺激脾淋巴细胞产生的白细胞介素II增加2-5倍，巨噬细胞产生的白细胞介素I增加1.5-2倍，从而提高机体免疫功能，可以作为抗癌放化疗的辅助用药(Zhang Junping等，1992)。斑蝥的药用机理研究及其资源的开发利用日益受到人们的重视。在我国，以斑蝥素为主要成分的抗癌药物已经有10种以上，如奇宁片(斑蝥酸钠片)、奇宁注射液、得力生注射液、艾康注射液(斑蝥酸钠+维生素B6)、依尔康注射液(去甲斑蝥酸钠注射液)、甲基斑蝥素片、去甲斑蝥素片、甲基斑蝥胺片、复方斑蝥胶囊等。其中，复方斑蝥胶囊对一些恶性肿瘤有良好的治疗效果，该药既可提高患者免疫能力，激活抑癌基因，又能杀死癌细胞，有着双重作用，2002年国家药监局将其评选为通用治癌药物。同时也是国家中药保护品种。

生物活性小分子由于不具备完全抗原性，因此不能直接采用免疫方法检测。目前，对于小分子生物活性物质的检测主要使用气相色谱、液相色谱等方法，斑蝥素的分析鉴定目前主要用气相色谱等方法。这些方法都只能检测游离状态的斑蝥素，而且需要专门的设备。在斑蝥素的生物合成研究、药物中斑蝥素成分鉴定、产斑蝥素昆虫的选育等方面常常需要快速简便的方法，有时还需要对组织细胞内的斑蝥素进行原位检测。采用免疫学方法检测则有着快速、灵敏、特别是能够进行原位检测的优点，但斑蝥素人工抗原的制备迄今未见有文献记载。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以天然斑蝥素为抗原决定簇，以β-丙氨酸为连接臂，将斑蝥素与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)经缩合、偶联、结晶而得斑蝥素人工完全抗原的制备方法。

本发明的技术方案如下：使天然斑蝥素与β-丙氨酸进行缩合反应，将中间产物的提取结晶纯化，中间产物再与载体蛋白偶联等步骤制得具有免疫原性的完全抗原。

本发明是这样实现的：

步骤1，N-羧乙基斑蝥酰亚胺的制备及纯化，

(1)在双口烧瓶中加入天然斑蝥素结晶以及β-丙氨酸，摩尔比为1∶1.1～1∶1.4，加入10ml～20ml冰醋酸使之能将上述反应后物质溶解，促进天然斑蝥素结晶与β-丙氨酸反应，装上冷凝管，温度计，35～40℃水浴4～6小时。然后蒸去冰乙酸，加入10ml～20ml三乙胺少量作为催化剂和反应物，使之将上述反应后物质溶解，同时加装吸湿干燥球，升温到135℃～140℃反应4～6小时。反应过程如下：

(2)反应结束后，蒸去三乙胺，用稀盐酸调酸碱度为pH 1～2，随后，用乙酸乙酯萃取，可根据情况萃取多次，保留黄绿色水相，浓缩近干；用甲醇冲洗，过滤，滤液浓缩近干，最后用乙酸乙酯重结晶，得精制N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶其结构式为

(3)取N-羧乙基斑蝥酰亚胺结晶溶解在二氯甲烷中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，摩尔比为1∶2∶2，混合后室温下搅拌反应18～24小时后进行减压蒸发，所得浓缩物用二氯甲烷进行重结晶。结晶溶解于少量吡啶中将结晶完全溶解形成吡啶溶液；取BSA(牛血清白蛋白)或OVA(卵清白蛋白)溶解在0.03mol/L的磷酸缓冲液中，其中BSA或OVA与N-羧乙基斑蝥酰亚胺的摩尔比为1∶20～1∶30；将N-羧乙基斑蝥酰亚胺吡啶溶液与BSA或OVA磷酸缓冲液混合，混合液在4℃下搅拌反应12～24小时后进行透析、冷冻干燥，得斑蝥素人工完全抗原。

步骤2，N-羧乙基斑蝥酰亚胺的检测：

(1)紫外波谱分析鉴定